ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/225 A61P31/12 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии вирусных вакцинных ветеринарных препаратов, в частности к вакцине «ОРОВАК-ТГЭ» против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, предназначенной для пероральной иммунизации супоросных свиноматок, поросят и хряков ремонтной и основной групп.

Известна вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 (SU 734279, 21.12.1978).

Недостатком данной вакцины является значительная потеря ее антигенной и иммуногенной активности при производстве и последующем хранении, из-за низкой устойчивости вакцинного вируса к сублимационному высушиванию и, как следствие, к снижению ее эффективности.

Целью изобретения является повышение эффективности вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Указанная цель достигается тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №510,33-11,74сахароза4,31-4,80пептон ферментативный3,13-3,69казеин0,78-1,11тиомочевина0,04-0,70аэросил АМ-1-3001,00-2,00смола КБ-4П-2остальное.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для получения вирусного материала из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 используют культуру СПЭВ, выращенную в роллерных условиях с образованием монослоя через 20-48 часов. Ростовую среду заменяют поддерживающей средой того же состава, но без сыворотки, с добавлением вируса. Множественность заражения составляет 1-10 ТЦД₅₀ на 1 клетку. Инфицированную культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 16-30 часов. Вирусный материал хранят при минус 20°С.

Перед приготовлением вакцины "ОРОВАК-ТГЭ" компоненты вакцины: сахарозу, пептон ферментативный, казеин и тиомочевину (каждый компонент в отдельности) подвергают тепловой обработке, при температуре 90°С, а смолу КБ-4П-2 в смеси с гидрофобным аэросилом при температуре 102±2°С в течение 4 часов, с последующим их охлаждением до температуры 4±2°С. В аппарат типа РТ-1 последовательно загружают вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 в объеме 14-15 л; сахарозу в количестве 5,5-6,5 кг; пептон ферментативный в количестве 4-5 кг; казеин в количестве 1-1,5 кг и 0,05-0,1 кг тиомочевины. Смешение - растворение компонентов в аппарате проводят при 8000 об/мин в течение 2 минут.Полученную суспензию вакцинного полуфабриката переносят в барабан шаровой мельницы, в котором осуществляют его смешивание и обезвоживание, в соотношении 1:4, с ионнообменной смолой КБ-4П-2 с нанесенным на поверхность ее частиц гидрофобного аэросила АМ-1-300, взятого по массе в количестве 1,25-2,50%. Скорость вращения барабана 60-90 об/мин.

Получают 3 состава предложенной вакцины, приведенной в таблице 1. Готовый вакцинный продукт «ОРОВАК-ТГЭ» представляет собой сыпучий порошок серо-желтого цвета. Биологическая активность препарата не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/г^-1. Массовая доля влаги в пределах 10-14%.

Вакцину расфасовывают по 100-200 г в стерильные флаконы или двойные полиэтиленовые пакеты. Флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а пакеты герметично запаивают.

Срок годности вакцины - 6 месяцев при условии хранения в темном помещении при температуре 2-10°С.

Пример 2.

Изучают биологическую активность 3-х образцов вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленных по примеру 1 и хранившихся в течение 12 месяцев при температуре минус 8-12°С; 2-10°С; 18-20°С. Количественную оценку вирусной активности определяют путем титрования по ЦПЭ в клеточной линии СПЭВ. Клеточную суспензию в концентрации 4·10⁵ клеток в см³ наносят на 96-луночные плашки по 0,01 см³ в каждую лунку. Инкубирование проводят в СО₂ инкубаторе. Монослой формируется на вторые сутки. В опытах используют плашки со сплошным монослоем. Готовят 10-кратные разведения вируса с 10^-1 до 10^-8. На каждое разведение используют по 4 лунки, вирус вносят по 0,05 см³. Зараженную куль-туру инкубируют 5-7 дней. Титр вируса выражают в ТЦД₅₀/см³. Результаты по изучению устойчивости вирусвакцины «ОРОВАК-ТГЭ» в зависимости от условий хранения представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что наилучшие условия сохранности биологическоской активности вакцины обеспечивает температурный режим минус 8-12°С, при этом за 12 месяцев хранения активность снижается в среднем на 0,8 lg ТЦД₅₀. Температура 2-10°С обеспечивает сохранность активности на высоком уровне только в течение 6 месяцев, а температура 18-20°С вызывает значительную инактивацию вируса.

Пример 3.

Исследуют безвредность 3 образцов вакцины "ОРОВАК-ТГЭ", приготовленных по примеру 1 из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5. Для контроля используют 6 подсвинков, серонегативных к вирусу ТГЭ свиней (по 2 на каждый образец). Навески вакцины массой 1 г суспендируют в 10 см³ стерильного физиологического раствора. Приготовленную суспензию вводят животным в объеме 5 см³ в область шеи или бедра.

Контрольное наблюдение за животными ведут в течение 10 суток с ежедневным измерением температуры тела. Все животные остались живы. Клиническое состояние подопытных животных не отличалось от нормы и от группы контроля.

Таким образом, исследуемые образцы вакцины безвредны.

Пример 4.

Изучают антигенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленного по примеру 1 и хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С. Сухую вакцину смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма, который раскладывают равномерным слоем в кормушки для скармливания животным перед утренним кормлением. Супоросным свиноматкам дозу вакцины скармливают за 10-14 дней до опороса по 10 г препарата на голову. Поросятам дозу вакцины (5 г) скармливают через 10-14 суток после отъема.

Об антигенной активности судят по образованию вируснейтрализующих антител к вирусу ТГЭ у иммунизированных свиноматок на 7, 14, и 21 день после вакцинации; у иммунизированных поросят на 35 день после применения вакцины. Определение титра антител проводят в реакции нейтрализации против вируса ТГЭ, штамм «ВГНКИ-5», в разведении, соответствующему 100 ТЦД₅₀/0,1 см³. Реакцию ставят стандартным методом, используя культуру клеток СПЭВ. Результат учитывают через 5 дней после постановки реакции. За титр нейтрализующих антител принимают наивысшее разведение сыворотки, которое полностью ингибирует цитопатический эффект вируса ТГЭ.

Свиней считают серонегативными к вирусу ТГЭ, если их сыворотка крови в разведении 1:2 не обладала вируснейтрализующей активностью. До вакцинации в сыворотке крови подопытных животных специфические вируснейтрализующие антитела к вирусу ТГЭ отсутствовали.

Динамика антител у животных, вакцинированных вторым опытным образцом «ОРОВАК-ТГЭ», представлена в таблице 3.

Как видно из результатов таблицы 3, иммунизация вторым опытным образцом вакцины индуцирует образование вируснейтрализующих специфических антител у свиноматок на 7 день исследования, а у поросят на 35 день в титрах 1:128-256.

Таким образом, антигенный компонент является активным и вакцина пригодна для применения.

Пример 5.

Испытывают иммуногенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С, приготовленного по примеру 1. Сухую вакцину с биологической активностью 6,25 lg ТЦД₅₀/г^-1 смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма. Полученную смесь равномерным слоем расклавают в кормушки для скармливания 4 супоросным свиноматкам. Вакцину скармливают животным перед утренним кормлением в дозе 10 г на голову, в течение 3-х дней подряд, за 10-14 дней до опороса. У всех свиноматок, получивших вакцину «ОРОВАК-ТГЭ» в течение всей продолжительности опыта изменений клинических признаков не отмечено. На 10-14 день поросят отнимают от свиноматок и формируют в 4 опытные группы.

Вакцину скармливают всем поросятам также перед утренним кормлением в дозе 5 г на голову. В качестве контроля используют поросят от не вакцинированных свиноматок, которым вакцину не скармливают.

Эффективность иммунизации поросят контролируют через 21 день по титрам антител, выявленным в реакции нейтрализации и по результатам контрольного заражения привитых поросят культурой вирулентного штамма «Мюллер» вируса ТГЭ в дозе 1000 ЛД₅₀/0,2 см³. У 12 опытных поросят после заражения отмечали слабость, лихорадку (40,5-41,5°С), 5 из которых на 4-5 сутки после появления сильной диареи погибли.

Результаты по иммунизации поросят 2 опытным образцом вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» представлены в таблицах 4 и 5.

Данные таблиц 4 и 5 говорят о том, что опытный образец вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» №2 индуцирует у всех опытных поросят выработку специфических антител в титрах 1: 32-256, тем самым обеспечивая их надежную защиту от контрольного заражения, в среднем на 84,8%. У поросят из группы контроля на вторые сутки после заражения отмечают отсутствие аппетита, жажду, слабость, лихорадку, сильную диарею - желтоватые пенистые фекалии. На 3 день после наступления комы все поросята погибли.

Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ», изготовленная по технологии контактного обезвоживания, для перорального применения безвредна для свиноматок и поросят, не вызывает поствакцинальных реакций; высокоиммуногенна (защита от вируса ТГЭ на 75-100%) и экологически безопасна для обслуживающего персонала.

Использование вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» для иммунизации животных позволит сократить затраты и повысить эффективность мероприятий по борьбе с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней.

Таблица 1Компоненты:Содержание компонентов, мас.%:Состав 1Состав 2Состав 3Вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №510,3311,01611,74Сахароза4,804,5584,31Пептон ферментативный3,693,4193,13Казеин1,110,9500,78Тиомочевина0,700,0570,04Аэросил AM-1-3002,001,5001,00Смола КБ-4П-2ОстальноеОстальноеОстальноеТаблица 2Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ»Биологическая активность, lg ТЦД₅₀/г^-1Вакцина после приготовленияХранение при t (°С) в течение (мес.)612минус 8-122-1018-20минус 8-122-1018-20Опытный образец №16,76,56,105,05,94,03,8Опытный Образец №26,66,66,254,85,84,24,1Опытный Образец №36,56,46,104,75,74,24,0

Таблица 3ВидСроки исследований, дниЖивотныхДо вакцинации7142135Свиноматки     №101:81:641:256-№201:81:641:256-Поросята     №10---1:256№20---1:128№30---1:128№40---1:256№50---1:256№60---1:128Таблица 4 Титр вируснейтрализующих специфических антител в сыворотках крови опытных поросят №Группа №1Группа №2Группа №3Группа 411:2561:2561:2561:25621:641:1281:1281:6431:1281:1281:1281:6441:1281:1281:2561:25651:1281:1281:1281:12861:641:641:641612871:1281:641:1281:12881:641:1281:64-9--1:128-10--1:32-

Таблица 5№ группыКол-во поросят в группеСредний геометрический титр поствакцинальных антителРезультаты контрольного зараженияВыжилоКлинически переболелоИз них пало% выживших18100632752823073187,5310110,28428047126,5720100Всего33 2812584,8Контроль100010100

Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцина содержит вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 и дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%: вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 - 10,33-11,74, сахароза - 4,31-4,80, пептон ферментативный - 3,13-3,69, казеин - 0,78-1,11, тиомочевина - 0,04-0,70, аэросил AM-1-300 - 1,00-2,00, смола КБ-4П-2 - остальное. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, безвредна, экологически безопасна. 5 табл.

Вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №510,33-11,74Сахароза4,31-4,80Пептон ферментативный3,13-3,69Казеин0,78-1,11Тиомочевина0,04-0,70Аэросил AM-1-3001,00-2,00Смола КБ-4П-2Остальное