АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ (TRANSMISSIVE GASTROENTERITIS VIRUS) Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 A61K39/225 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС), и может быть использовано для изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

В настоящее время в различных регионах мира выделено большое количество изолятов вируса ТГС, которые не имеют серотипических различий, и по результатам реакции нейтрализации отнесены к одному серотипу. Выделенные вирулентные изоляты вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых поросят 1-10 дневного возраста, полученных от неимунных к вирусу ТГС свиноматок. Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней, выделенный в США, имел следующие характеристики: размножался в культуре клеток ST (клетки тестикул поросят) в титре 6,0 lg ЦПД 50/см³. При электронно-микроскопических исследованиях вирусных частиц имели структуру, присущую вирионам рода коронавирусов (Pensaert, 1986).

Действие вакцин против ТГС основано на том, что вируснейтрализующие коллостральные антитела, вырабатывающиеся в организме свиноматки в ответ на введение вакцинного вируса, обеспечивают защиту подсосных поросят от заражения вирулентным вирусом трансмиссионного гастроэнтерита свиней.

В настоящее время для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней в России и за рубежом распространение получили живые и инактивированные вирусовакцины из аттенуированных или убитых штаммов вируса ТГС.

В Российской Федерации для специфической профилактики ТГС применяют вакцинные штаммы "N4 ВГНКИ" и "МК- 25" вируса трансмиссивного гастроэнтерита производства ВГНКИ. Штаммы аттенуированы длительным пассированием на перевиваемой культуре клеток. Вирус размножается в культуре клеток тестикул поросенка (ПТП) с титром 5-5,5 lg ЦПД50/см³. На основе данных штаммов были разработаны живые вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (А.С. N 734279, "Вакцинный штамм вируса ТГС "N 5 ВГНКИ" и П. N 1238294, A 61 K 39/225 "Вакцинный штамм вируса ТГС МК-25"). Применение перечисленных вакцин не позволяет, в дальнейшем, определить какой из штаммов, вакцинный или вирулентный, циркулирует среди поголовья после проведения специфической профилактики.

Целью изобретения является получение нового штамма вируса ТГС, пригодного для изготовления вакцины против ТГС, имеющего такие антигенные свойства, которые позволяли бы отличить данный вакцинный вирус ТГС от вирулентных штаммов вируса ТГС по антигенной структуре и по индуцированной данным вакцинным штаммом сероконверсии.

Вакцинный штамм вируса трансмиссионного гастроэнтерита свиней получен путем его аттенуирования пассированием на культуре клеток ПТП с параллельным клонированием и отбором клонов, имеющих антигенные отличия от исходной популяции вирулентного вируса.

Новый аттенуированный штамм обладает следующими свойствами:
Морфологические свойства: При электронно-микроскопическом исследовании в вирусосодержащем материале обнаруживают вирусные частицы, размером 80-150 нм, морфологически тождественные представителям рода Coronavirus семейства Coronaviridae.

Культуральные свойства: Штамм "Горский-95" вируса трансмиссионного гастроэнтерита свиней размножается в перевиваемых культурах клеток ПТП и СПЭВ с выраженным ЦПД, проявляющемся в округлении и гибели клеток с последующей деструкцией монослоя. Титр вируса в указанных культурах клеток достигает 10^4.0-5,5 ТЦД50/см³.

Способ выращивания: Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток ПТП в стационарных и роллерных культурах. При оптимальных условиях максимальное наклонение вируса достигается через 72 часа культивирования. В качестве поддерживающей среды используют среду ИГЛА-МЕМ без сыворотки.

Антигенные маркеры: Данный штамм отличается от вирулентных штаммов вируса ТГС отсутствием на поверхностном гликопротеине (S) не нейтрализующей антигенной детерминанты, которая всегда присутствует на соответствующем гликопротеине вирулентных штаммов вируса ТГС. Данная детерминанта распознается моноклональными антителами клона Т9С9.2
Антигенные свойства: Вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител.

Гемагглютинирующие свойства: Не обладает.

Патогенность для человека: Не патогенен.

Вирулентность для восприимчивых животных: Не вирулентен.

Безвредность для лабораторных животных: Безвреден.

Контагиозность: Не контагиозен.

Реверсибельность: Не реверсибелен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами: Не контаминирован.

Иммуногенные свойства. Индуцирует формирование иммунитета против ТГС у свиней, а также коллостральных антител у свиноматок.

Стабильность и генетических и иммунобиологических признаков: Стабильность данных признаков сохранялась начиная с 31 по 50 пассаж (срок наблюдения).

Способ и срок хранения, периодичность пассажей: Штамм хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40^oC и "освежают" пассированием в культуре клеток ПТП один раз в пять лет.

Предлагаемый аттенуированный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней был обозначен как штамм "Горский-95" и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ за инв. N 1941 от 24 февраля 1997 (справка о депонировании прилагается),
Иммунобиологические свойства штамма "Горский-95" проведены в комиссионных испытаниях при депонировании штамма во ВНИИВВиМ (акт от 11 февраля 1997 г).

Изобретение предназначено для изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Новый вакцинный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) получен путем аттенуирования вируса ТГС пассированием на культуре клеток ПТП с параллельным клонированием и отбором клонов, имеющих антигенные отличия от исходной популяции вирулентного вируса. Данный штамм отличается от вирулентных штаммов вируса ТГС отсутствием на поверхностном гликопропеине (S) не нейтрализующей антигенной детерминанты, которая всегда присутствует на соответствующем гликопротеине вирулентных штаммов вируса ТГС. Данная детерминанта распознается моноклональными антителами клона Т9С9.2, что позволяет отличать данный вакцинный вирус ТГС от вирулентных штаммов вируса ТГС по антигенной структуре и по индуцированной сероконверсии методами твердофазного иммуноферментного анализа и гистохимического иммуноферментного анализа. Полученный штамм характеризуется высокой репродуцирующей способностью в культуре клеток ПТП с проявлением характерного ЦПЭ и накоплением вируса в титре до 10⁵ ТЦД 50/см³, безвредностью, ареактогенностью, высокой иммуногенной активностью, отсутствием контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм антигенно стабилен, неконтагиозен, нереверсибелен. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ за инв. N 1941 от 24 февраля 1997 г. Штамм имеет антигенные свойства, позволяющие отличить его от вирулентных штаммов вируса ТГС по антигенной структуре и по индуцированной данным вакцинным штаммом сероконверсии.

Аттенуированный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (Transmissive gastroenteritis virus), депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ за инв. N 1941 от 24.02.1997, пригодный для изготовления вакцинных препаратов.