ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/77 G01N33/569 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью изучения вирусов и использования в диагностических исследованиях.

Для первичной изоляции вирусов африканской чумы свиней (АЧС), классической чумы свиней (КЧС), болезни Ауески (БА) и ряда других используются клетки гемопоэтической системы свиней, так как они являются естесственно-пермиссивными клеточными системами для их репродукции (1, 2, 3).

Эти культуры являются первичными, переживающими (не размножаются в культуре) и для их получения необходимо производить убой подсвинков для получения костной ткани или содержать доноров.

Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам - возбудителям болезней свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески.

Штамм клеток СПМ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантатов в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS).

В качестве анатомического источника эксплантатов синовиальной мембраны были использованы карпальные суставы донора.

Исходная ткань гетерогенна в популяционном составе и включает клетки: макрофагальные синовиациты (А-клетки), фибробластические синовиациты (В-клетки) и промежуточные формы синовиацитов (С-клетки), а также тканевые макрофаги, фибробласты, плазматические клетки, тучные клетки и мононуклеарные клетки крови.

Для выделения и репродукции вируса африканской чумы свиней и производства диагностических препаратов в качестве клеточного субстрата используются культуры клеток костного мозга свиней (ККМС), лейкоцитов свиней (ЛС) и легочных альвеолярных макрофагов, которые является первичными, переживающими (не размножается в культуре) и для их получения необходимо производить убой подсвинков или содержать доноров. Преимуществом штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) является то, что они размножаются в культуре и не нужно производить убой животных. Клетки СМП можно криоконсервировать в жидком азоте и после размораживания они сохраняют свои основные биологические свойства, включая чувствительность к вирусам.

Штамм СМП характеризуется следующими признаками.

Культуралъные свойства. При посевной дозе - 150-200×10³ клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 9-10 дней на стекле и до 30 дней на пластике. Коэффициент пересева - 1:2-1:3.

Штамм СМП культивируют в монослойных культурах в среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 2:1 при температуре 37°C. Урожай клеток с литрового матраса составляет 45-50 млн. клеток.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°C применяют смесь, состоящую из 70% среды ДМЕМ, 20% FBS и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 6-8×10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 70-77%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 100 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 4, 5, 6 пассажа в ГНУ ВНИИВВиМ.

Морфологические признаки. Культура клеток представлена эпителиоподобными клетками средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика. (n=38) диплоидный набор хромосом.

Видовая идентичность подтверждена видоспецифической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Прививаемость изогенным животным отсутствует.

Контроль штамма СМП на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма СПМ на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам.

При изучении чувствительности культуры клеток СМП к вирусам используют культуры РК-15 и вирусы африканской чумы свиней (АЧС_, штамм 691/68, классической чумы свиней (КЧС), штамм ЛК-ВНИИВВиМ, болезни Ауески, штамм Бук-900. Накопление вирусных антигенов в клетках полученной культуры определяют методом прямой иммуноф люоресценции.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) 07.07. 2011 г. за №81. Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример №1.

Выделенную синовиальную мембрану 3-х кратно промывают средой DMEM (pH 7,2-7,4) с добавлением комплекса антибиотиков (пенициллин/стрептомицин) и измельчают в чашке Петри на фрагменты размером не более 2 мм. Далее, полученные эксплантаты еще раз трехкратно промывают и переносят в культуральные флаконы с питательной средой DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят и комплекс антибиотиков. Среду вносят небольшими количествами так, чтобы тканевые фрагменты не плавали в среде, а соприкасались с поверхностью матраса, но, в тоже время, и не подсыхали. Матрасы помещают в CO₂-инкубатор с автоматическим регулированием и контролем температуры (37,0±0,5°C), повышенным до 5% содержанием углекислого газа и относительной влажностью 90%. Дважды в неделю производят смену питательной среды.

Пример №2.

Для определения чувствительности культуры клеток к вирусу болезни Ауески используют вакцинный штамм Бук 900 с инфекционной активностью 7,5 в перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15. Максимальное накопление вируса БА в новой культуре клеток устанавливают через 48 часов культивирования по ЦПД и методом прямой иммунофлуоресценции (титр составляет 7,5 и 7,5 соответственно).

Изучение чувствительности культуры клеток СМП к вирусу КЧС (штамм ЛК-ВНИИВВиМ) проводят в 3-5 последовательных пассажах. В качестве исходного инфекционного материала используют освеженный в 2-х пассажах в первичной культуре тестикул ягнят вирус с инфекционной активностью не ниже 5,5 . Инфекционную активность вируса КЧС каждого пассажа, выращенного в культуре СМП, определяют титрованием в перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15 методом прямой иммунофлуоресценции. Установлено, что культура клеток СМП без адаптации чувствительна к вирусу КЧС, накопление которого достигает 4,5-5,5

При оценке пермиссивности культуры клеток СМП к вирусу АЧС (штамм 691/68) максимальное накопление вируса отмечают через 96 часов культивирования и титр вируса составляет 4,0 . Наличие антигенсодержащих клеток определяют методом прямой иммунофлуоресценции.

При использовании перевиваемых линий клеток для наработки вирусного сырья и в диагностических исследованиях необходима адаптация вируса, особенно полевых изолятов, что влечет за собой изменение биологических свойств вируса. Штамм диплоидных клеток СМП является естественно пермиссивной системой и не требует адаптации вирусов.

Таким образом, штамм клеток СМП может быть использован в вирусологических исследованиях для изучения вирусов классической чумы свиней, африканской чумы свиней, болезни Ауески, а также в диагностических целях.

Источники информации.

1. Malmquist W.A., Hay D. Hemadsorption and cytopathic effect produced by african swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures // Amer. J. Vet. Res., 1960, v.21, 80, p.104-108.

2. Mulder W.A.M., Priem J., Pol J.M.A., Kimman T.G., et. al. Expression of the envelope glycoprotein El of classical swin fever viruse by pseudorabies virus vector strains does not affect the in vitro replication of these vector viruses in porcine peripheral blood mononuclear cells // Immun. of viral infections, Proceeding 3rd Congress of the European Society for Veterinary Virology Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994, 1995, p.74-78.

3. Boynton W.H. Preliminary report on the propagation of hog cholera virus in vitro // Vet. Med., 1946, (41), p.346-347.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам-возбудителям болезням свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески. Штамм клеток СПМ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантатов синовиальной мембраны поросенка в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Культура клеток СМП чувствительна к вирусам классической чумы свиней, африканской чумы свиней, болезни Ауески и может быть использована для изучения вирусов, а также в диагностических исследованиях. Штамм СПМ хранится в коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №65 и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) за №81. 2 пр.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) за №81, используемый для вирусологических исследований.