ШТАММ КЛОНАЛЬНОЙ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК ПОЧКИ САЙГИ Saiga tatarica ПС/с4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2008 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Перевиваемая линия клеток ПС/с4 получена клонированием методом предельных разведений в малосывороточной питательной среде (содержание сыворотки крупного рогатого скота 0,5%) из сублинии перевиваемых клеток почки сайги ПС(ВНИИВВиМ) с отбором клона с/4 по признакам биологической стабильности и чувствительности к вирусам различных таксономических групп.

Известна перевиваемая линия клеток почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), полученная, в свою очередь, путем трофической переадаптации к среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и селекцией быстро растущих популяций клеток в процессе роллерного культивирования из перевиваемой линии клеток ПС(НИСХИ), культивируемой в питательной среде с 0,25% ФГМС на солевом растворе Эрла с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота (1).

Штаммы перевиваемых клеток ПС из-за того, что их культивировали в различных лабораториях при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, потеряли генетическую однородность (выраженность модального класса клеток) и, как следствие, стабильность биологических свойств культур клеток.

Кроме того, в настоящее время является актуальной задача разработки технологий получения культур клеток на основе питательных сред без сыворотки крови млекопитающих или с низким ее содержанием, решающей комплекс проблем, связанных с крупномасштабным промышленным изготовлением иммунобиологических препаратов на основе стандартных питательных сред.

Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки сайги, способного к росту в питательной среде с пониженным содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота, стабильного по биологическим характеристикам, включая пермиссивность к адаптированным вирусам, пригодного для научно-исследовательской работы и конструирования новых вакцинных препаратов.

Клональная перевиваемая линия ПС/с4 получена из клеток сублинии ПС(ВНИИВВиМ) путем адаптации к росту в питательной среде на основе среды Игла MEM/ALPHA с включением в состав 0,5% сыворотки крови крупного рогатого скота с добавлением жирорастворимых витаминов А и Е, гормонов: тироксина, инсулина, гидрокортизона, дополнительного количества аминокислот: метионина и гистидина с последующим клонированием методом предельных разведений в этой малосывороточной питательной среде.

Штамм клональной перевиваемой линии ПС/с4 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели, составляет 50±10 пассажей. При посевной дозе - 100-120×10³ клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. Коэффициент пересева - 1:2-1:3.

Клетки клональной линии ПС/с4 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM/ALPHA с 0,5% сыворотки крови крупного рогатого скота и добавлением жирорастворимых витаминов А (ретинол ацетата) - 0,3-0,5 мг/л и Е (α-токоферол ацетата) - 10-20 мг/л, гормонов: тироксина - 0,03 мкг/л, инсулина пролонгированного действия - 4-8 ЕД/л, гидрокортизона - 0,1-0,2 мкг/л, дополнительного количества аминокислот: гистидина - 38 мг/л, метионина - 30 мг/л, рН 7,4-7,5.

Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 100:1 при температуре 37°С. Урожай клеток с литрового матраса составляет 40-45 млн.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды Игла-МЕМ, 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 10-15×10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 300 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 7, 10, 15, 19, 25 и 42 пассажей в ГНУ ВНИИВВиМ (регистрационный №31.2.).

Морфологические признаки. Клетки ПС/с4 эпителиоподобного типа, полигональной формы с четко выраженными границами и мелкозернистой цитоплазмой. Ядра округлой формы с 1-2 ядрышками.

Кариологическая характеристика. (2n=60). Интервал варьирования числа хромосом в клетках от 44 до 55. Модальное число 50 хромосом. Величина модального класса 80%.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

Контроль штамма ПС/с4 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток линии ПС/с4 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Клетки линии ПС/с4 чувствительны к вирусу бешенства, парагриппа-3 КРС (ПГ-3), чумы плотоядных, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС).

Клональная перевиваемая линия ПС/с4 может быть использована в качестве клеточного субстрата для применения в научно-исследовательской работе и для конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Штамм перевиваемых клеток ПС/с4 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №60.

Список литературы

1. Юрков С.Г., Зуев В.В., Сидоров С.И., Кушнир С.Д., Смыслова Н.Ю., Неверовская Н.С., Чермашенцева Н.А., Прилепская Е.П., Анисимова Л.И., Колбасова О.Л. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ // Покров, Россельхозакадемия, ВНИИВВиМ, 2000. - 80 с.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии. Получен штамм клональной перевиваемой линии клеток почки сайги, депонированный в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии СХЖ РАСХН под №60. Изобретение может использоваться с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Штамм клональной перевиваемой линии клеток почки сайги Saiga tatarica ПС/с4 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №60, используемый в вирусологических исследованиях.