ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ЯГНЕНКА Ovis aries, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/77 G01N33/569 

Описание патента на изобретение RU2507255C1

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Лентивирусы мелких жвачных (ЛМЖ) репродуцируются в перевиваемых культурах клеток эпендимы и сосудистого сплетения головного мозга овец, в астроцитах человека, африканской зеленой мартышки (Vero), в первичной культуре клеток легкого, селезенки, брюшины, сердца, мозжечка, семенников, надпочечников, почках овцы, синовиальной мембране козленка (СМК).

Сообщается о получении первичной культуры клеток синовиальной мембраны овцы и трансформации субкультуры (вторичной культуры) вирусом SV-40 и приводятся данные о морфологический, кариологических характеристиках данных культур и их чувствительности к вирусам висна-маеди и артрита-энцефалита мелких жвачных. Однако данных по установлению штамма, его криоконсервации и депонировании нет [4].

Известно, что продуктивная репликация ВАЭК связана с запуском механизма клеточного апоптоза. Данный факт является аргументом в пользу малопригодности перевиваемых линий клеток в качестве лабораторной модели, поскольку трансформация, происходящая в процессе адаптации клеток к условиям in vitro во многом изменяет генетический аппарат клеток, становящихся фактически бессмертными. Непригодность перевиваемых культур клеток для культивирования ЛМЖ также подтверждается данными об ограниченном типе репликации вируса в клетке, при котором происходит интеграция провирусной ДНК в геном клетки-хозяина, но стадии синтеза и сборки вирусных белков блокируются защитными механизмами клетки. В данном случае возможна персистенция вируса в форме интегрированного генома, но при отсутствии продуктивной инфекции с формированием полноценных вирусных частиц.

Для получения первичных культур клеток необходимо содержать доноров, производить убой ягнят, что приводит к материальным, временным затратам. Кроме того, у данных культур отсутствует стандартность, и существует высокая возможность контаминирования эндогенными вирусами [1, 2, 3].

Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка, пермиссивной к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)), пригодный для вирусологических исследований и конструирования новых антигенных препаратов.

Для получения штамма диплоидных клеток СМЯ применяют метод выращивания тканевых эксплантатов. После убоя животного в асептических условиях отбирали карпальные и путовые суставы, удаляют кожный покров и обрабатывают 96% спиртом в течение 15-30 секунд. Изолированную синовиальную мембрану переносили в чашку Петри с питательной средой ДМЕМ, содержащей 2% фетальной сыворотки крови телят и антибиотики (бензилненициллина натриевую соль 150 ЕД/мл и гентамицин 100 мкг/мл), механически измельчают с помощью ножниц на тканевые фрагменты до величины 1-2 мм, затем трижды отмывали средой того же состава.

Эксплантаты помещают в культуральные флаконы с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят и комплексом антибиотиков, и инкубировали в атмосфере с повышенным до 5% CO2 при 37±0,5°C с относительной влажностью воздуха 90%. Дважды в неделю проводят смену питательной среды.

Определение пермиссивности СМЯ к лентивирусам мелких жвачных (ЛМЖ). Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах в пробирках, заражают ВАЭК штаммом - 75G-63 и ВВМ штаммом М-88 путем контакта вируса в течение 2 ч с монослоем клеток в дозе 0,1-0,01 ТЦД/кл.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ характеризуется следующими признаками.

Кулътуцальные свойства. При коэффициенте пересева 1:2-1:3 монослой формируется на 3-5 сутки и сохраняется без смены среды на стекле в течение 8-9 дней, на пластике - до 3-х недель.

Штамм клеток культивируют в среде ДМЕМ, содержащей 10%

фетальной сыворотки крови телят, рН 7,2-7,4.

Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 2:1, подогретую до 37°С. Урожай клеток с литрового матраса составляет 50-55 млн.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ сохраняет свои морфологические свойства на протяжении 30 пассажей.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды ДМЕМ, 20% сыворотки крови телят, 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 10-15 ×10 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 36-45%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 10 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 3, 4, 5-го пассажей в ГНУ ВНИИВВиМ (регистрационный №64).

Морфологические признаки. Фибробластоподобные клетки средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика штамма: (n=54) соответствует диплоидному набору хромосом.

Видовая идентичность подтверждена молекулярно-генетическим (ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) методом.

Контроль штамма клеток СМЯ на посторонние контаминанты. При обследовании штамма клеток СМЯ на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Для определения чувствительности культуры клеток к лентивирусам мелких жвачных используют штамм М-8 8 вируса висна-маеди с инфекционной активностью 3,5 lgТЦД50/см3 в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ), штамм 75G-63 вируса артрита-энцефалита коз с инфекционной активностью 5,0 lgТЦД50/см3 в сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК). Максимальное накопление вируса в новой культуре клеток устанавливают через 3-4 суток культивирования по ЦПД. Титр составляет 5,5 lgТЦД50/см3 и 5,5 lg ТЦД50/см3 соответственно).

Чувствительность полученного штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) к вирусу висна-маеди (штамм М-88) на 2 lg ТЦД50/см3 и вирусу артрита-энцефалита коз (штамм 75G-63) на 0,5 lgТЦД50/см3 выше, чем в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ) и сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК) соответственно.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries СМЯ депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) 07.07. 2011 г.под №82.

Штамм клеток СМЯ может быть использован в качестве клеточного субстрата для применения в вирусологических исследованиях и для конструирования новых антигенных препаратов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример №1.

Культуру клеток СМЯ с 90%-м монослоем, не отличающуюся по морфологическим признакам от исходной популяции, использовали для получения вирусных антигенов Клетки культивировали в пластиковых матрасах, объемом 0,5 л. Заражение проводили путем контакта 2-3 см вируссодержащей культуральной жидкости (штамм 75G-63 вируса АЭК и штамм М-88 вируса ВМ) с инфекционной активностью 105,0 lgТЦД50/см3 с монослоем клеточной культуры в течение 1,5-2 часов при 37±0,5°С. Затем добавляли поддерживающую среду ДМЕМ с 2% FBS. Культуру клеток СМЯ культивировали до проявления характерного ЦПД. После этого проводили 3-кратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала и культуральную жидкость подвергали низкоскоростному центрифугированию (600 g) для осаждения клеточного детрита. Супернатант ультрацентрифугировали при 140 тыс. g в течение 4 ч. Полученный осадок растворяли буферным раствором в 50 раз меньше исходного объема. Полученные антигены использовали для анализа полипептидного состава методом электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноблотинга, РДП.

Для получения гипериммунных сывороток вируссодержащий материал (штамм М-88 вируса ВМ с титром 105,0ТЦД50/см3) вводили ягнятам 2-3-месячного возраста в объеме 1-2 см3 интратрахеально и 2-3 см3 интрапульмонально каждые 3 дня в течение месяца. Для получения сыворотки отбор крови проводили каждые 7 дней и исследовали их активность в ИФА (набор фирмы ID Vet, Франция). При этом титр антител составил 1:80-1:160. Максимальный титр антител в ИФА получен на 14 сутки.

В отличие от перевиваемых и первичных культур клеток, используемых для изучения и репродукции вирусов - возбудителей медленных инфекций (висна-маеди, артрита- энцефалита коз) монослой штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) сохраняется до трех недель, что целесообразно при работе с исследуемыми патогенами, особенно полевыми изолятами вирусов с низким титром активности.

Источники информации

1. Инфекционная патология животных: в 2Т / Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 1911 с.

2. Сидельников Г.Д., Биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз: Дис.… канд. вет.наук 16.00.03 / Георгий Дмитриевич Сидельников - Покров, 2009. - 117 с.

3. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Н.Ф. Фомина.- М.: Колос, 1979. - 472 с.

4. Establishment and partial characterization of an ovine synovial membrane cell line obtained by transformation with Simian Virus 40 Т antigen / U.M. Costa, D. Reischak, J. da Silva, A.P. Ravazzolo // Journal of Virological Methods. - 2005. - Vol.128, Issues 1-2. - P. 72-78.

Похожие патенты RU2507255C1

название год авторы номер документа
МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2005
  • Дьяконов Лев Петрович
  • Савенко Наталья Борисовна
  • Симонова Алла Сергеевна
  • Белоусова Раиса Васильевна
  • Кленовицкий Павел Михайлович
RU2306334C2
ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2012
  • Колбасова Ольга Львовна
  • Юрков Сергей Григорьевич
  • Неверовская Наталья Сергеевна
  • Дмитренко Виктор Владимирович
  • Лыска Валентина Маркеловна
RU2506310C1
TCh (Testis Capra hircus) - перевиваемая монослойная сублиния клеток тестикул месячного козлёнка, предназначенная для репродукции вирусов оспы, чумы мелких жвачных животных и заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов 2021
  • Манин Борис Леонидович
  • Трофимова Елена Александровна
  • Гусарова Светлана Евгеньевна
  • Кононова Светлана Владимировна
  • Шумилова Ирина Николаевна
  • Вологина Ирина Викторовна
  • Колчанов Николай Александрович
RU2768962C1
ШТАММ ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (OVIS ARIES) СО СПЛЕНОЦИТАМИ ОВЦЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ 2001
  • Куликова И.Л.
  • Гальнбек Т.В.
  • Дьяконов Л.П.
  • Симонова А.С.
  • Шуляк А.Ф.
  • Ярных Е.В.
RU2203318C1
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ДНК-ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПЦР ИЛИ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2013
  • Герасимова Надежда Николаевна
  • Панферова Агнеса Владимировна
  • Колбасова Ольга Львовна
  • Колбасов Денис Владимирович
RU2548799C1
Способ получения четырехкомпонентной культуральной живой вакцины против кори, ветряной оспы, эпидемического паротита, краснухи 2019
  • Зверев Виталий Васильевич
  • Нагиева Фирая Галиевна
  • Баркова Елена Петровна
  • Осокина Ольга Владимировна
RU2717769C1
ШТАММ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (OVIS ARIES) С БЕТА-КЛЕТКАМИ КРОЛИКА - ПРОДУЦЕНТ ИНСУЛИНА 2005
  • Дьяконов Лев Петрович
  • Эрнст Лев Константинович
  • Гальнбек Татьяна Валерьевна
  • Симонова Алла Сергеевна
  • Шевцова Наталья Александровна
  • Скалецкий Николай Николаевич
  • Зиновьева Наталья Анатольевна
  • Кленовицкий Павел Михайлович
RU2293116C1
ШТАММ 8С12 ПОСТОЯННОЙ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus И ОВЦЫ Ovis aries - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377297C1
ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377299C1
ШТАММ 1Н8 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG ОВЦЫ 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377298C1

Реферат патента 2014 года ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ЯГНЕНКА Ovis aries, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых антигенных препаратов. Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для научно-исследовательской и диагностической работы, обладающего пермиссивностью к лентивирусам мелких жвачных, пригодный для научно-исследовательской работы и конструирования новых антигенных препаратов. Штамм диплоидных клеток СМЯ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантантов в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Штамм клеток СМЯ чувствительна к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)). Штамм клеток СМЯ хранится в коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №64 и депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко под №82. 1 пр.

Формула изобретения RU 2 507 255 C1

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries СМЯ депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) под №82, используемый в вирусологических исследованиях.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2507255C1

ЛИНИЯ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КОЗЫ ДОМАШНЕЙ Capra hircus L. ЯДК-04 ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ 2006
  • Герасимов Виктор Николаевич
  • Герасимова Наталья Ивановна
  • Дьяконов Лев Петрович
  • Груздев Константин Николаевич
  • Захаров Валерий Михайлович
  • Манин Борис Леонидович
RU2335537C2
ЛИНИЯ КЛЕТОК ICO ЯИЧНИКОВ НЕПОЛОВОЗРЕЛОГО КАРПА (CYPRINUS CARPIO) ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2007
  • Щелкунов Игорь Степанович
  • Щелкунова Татьяна Ивановна
RU2353650C1
RU 2009113671 A, 20.10.2010
ЛИНИЯ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КОЗЫ ДОМАШНЕЙ Capra hircus L. ЯДК-04 ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ 2006
  • Герасимов Виктор Николаевич
  • Герасимова Наталья Ивановна
  • Дьяконов Лев Петрович
  • Груздев Константин Николаевич
  • Захаров Валерий Михайлович
  • Манин Борис Леонидович
RU2335537C2
ЛИНИЯ КЛЕТОК ICO ЯИЧНИКОВ НЕПОЛОВОЗРЕЛОГО КАРПА (CYPRINUS CARPIO) ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2007
  • Щелкунов Игорь Степанович
  • Щелкунова Татьяна Ивановна
RU2353650C1
RU 2009113671 A, 20.10.2010.

RU 2 507 255 C1

Авторы

Барышникова Елена Ивановна

Колбасова Ольга Львовна

Даты

2014-02-20Публикация

2012-07-23Подача