ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ЯГНЕНКА Ovis aries, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/77 G01N33/569 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Лентивирусы мелких жвачных (ЛМЖ) репродуцируются в перевиваемых культурах клеток эпендимы и сосудистого сплетения головного мозга овец, в астроцитах человека, африканской зеленой мартышки (Vero), в первичной культуре клеток легкого, селезенки, брюшины, сердца, мозжечка, семенников, надпочечников, почках овцы, синовиальной мембране козленка (СМК).

Сообщается о получении первичной культуры клеток синовиальной мембраны овцы и трансформации субкультуры (вторичной культуры) вирусом SV-40 и приводятся данные о морфологический, кариологических характеристиках данных культур и их чувствительности к вирусам висна-маеди и артрита-энцефалита мелких жвачных. Однако данных по установлению штамма, его криоконсервации и депонировании нет [4].

Известно, что продуктивная репликация ВАЭК связана с запуском механизма клеточного апоптоза. Данный факт является аргументом в пользу малопригодности перевиваемых линий клеток в качестве лабораторной модели, поскольку трансформация, происходящая в процессе адаптации клеток к условиям in vitro во многом изменяет генетический аппарат клеток, становящихся фактически бессмертными. Непригодность перевиваемых культур клеток для культивирования ЛМЖ также подтверждается данными об ограниченном типе репликации вируса в клетке, при котором происходит интеграция провирусной ДНК в геном клетки-хозяина, но стадии синтеза и сборки вирусных белков блокируются защитными механизмами клетки. В данном случае возможна персистенция вируса в форме интегрированного генома, но при отсутствии продуктивной инфекции с формированием полноценных вирусных частиц.

Для получения первичных культур клеток необходимо содержать доноров, производить убой ягнят, что приводит к материальным, временным затратам. Кроме того, у данных культур отсутствует стандартность, и существует высокая возможность контаминирования эндогенными вирусами [1, 2, 3].

Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка, пермиссивной к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)), пригодный для вирусологических исследований и конструирования новых антигенных препаратов.

Для получения штамма диплоидных клеток СМЯ применяют метод выращивания тканевых эксплантатов. После убоя животного в асептических условиях отбирали карпальные и путовые суставы, удаляют кожный покров и обрабатывают 96% спиртом в течение 15-30 секунд. Изолированную синовиальную мембрану переносили в чашку Петри с питательной средой ДМЕМ, содержащей 2% фетальной сыворотки крови телят и антибиотики (бензилненициллина натриевую соль 150 ЕД/мл и гентамицин 100 мкг/мл), механически измельчают с помощью ножниц на тканевые фрагменты до величины 1-2 мм, затем трижды отмывали средой того же состава.

Эксплантаты помещают в культуральные флаконы с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят и комплексом антибиотиков, и инкубировали в атмосфере с повышенным до 5% CO₂ при 37±0,5°C с относительной влажностью воздуха 90%. Дважды в неделю проводят смену питательной среды.

Определение пермиссивности СМЯ к лентивирусам мелких жвачных (ЛМЖ). Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах в пробирках, заражают ВАЭК штаммом - 75G-63 и ВВМ штаммом М-88 путем контакта вируса в течение 2 ч с монослоем клеток в дозе 0,1-0,01 ТЦД/кл.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ характеризуется следующими признаками.

Кулътуцальные свойства. При коэффициенте пересева 1:2-1:3 монослой формируется на 3-5 сутки и сохраняется без смены среды на стекле в течение 8-9 дней, на пластике - до 3-х недель.

Штамм клеток культивируют в среде ДМЕМ, содержащей 10%

фетальной сыворотки крови телят, рН 7,2-7,4.

Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 2:1, подогретую до 37°С. Урожай клеток с литрового матраса составляет 50-55 млн.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ сохраняет свои морфологические свойства на протяжении 30 пассажей.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды ДМЕМ, 20% сыворотки крови телят, 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 10-15 ×10 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 36-45%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 10 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 3, 4, 5-го пассажей в ГНУ ВНИИВВиМ (регистрационный №64).

Морфологические признаки. Фибробластоподобные клетки средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика штамма: (n=54) соответствует диплоидному набору хромосом.

Видовая идентичность подтверждена молекулярно-генетическим (ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) методом.

Контроль штамма клеток СМЯ на посторонние контаминанты. При обследовании штамма клеток СМЯ на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Для определения чувствительности культуры клеток к лентивирусам мелких жвачных используют штамм М-8 8 вируса висна-маеди с инфекционной активностью 3,5 lgТЦД_50/см ³ в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ), штамм 75G-63 вируса артрита-энцефалита коз с инфекционной активностью 5,0 lgТЦД_50/см ³ в сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК). Максимальное накопление вируса в новой культуре клеток устанавливают через 3-4 суток культивирования по ЦПД. Титр составляет 5,5 lgТЦД_50/см ³ и 5,5 lg ТЦД_50/см ³ соответственно).

Чувствительность полученного штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) к вирусу висна-маеди (штамм М-88) на 2 lg ТЦД_50/см ³ и вирусу артрита-энцефалита коз (штамм 75G-63) на 0,5 lgТЦД_50/см ³ выше, чем в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ) и сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК) соответственно.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries СМЯ депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) 07.07. 2011 г.под №82.

Штамм клеток СМЯ может быть использован в качестве клеточного субстрата для применения в вирусологических исследованиях и для конструирования новых антигенных препаратов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример №1.

Культуру клеток СМЯ с 90%-м монослоем, не отличающуюся по морфологическим признакам от исходной популяции, использовали для получения вирусных антигенов Клетки культивировали в пластиковых матрасах, объемом 0,5 л. Заражение проводили путем контакта 2-3 см вируссодержащей культуральной жидкости (штамм 75G-63 вируса АЭК и штамм М-88 вируса ВМ) с инфекционной активностью 10^5,0 lgТЦД_50/см ³ с монослоем клеточной культуры в течение 1,5-2 часов при 37±0,5°С. Затем добавляли поддерживающую среду ДМЕМ с 2% FBS. Культуру клеток СМЯ культивировали до проявления характерного ЦПД. После этого проводили 3-кратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала и культуральную жидкость подвергали низкоскоростному центрифугированию (600 g) для осаждения клеточного детрита. Супернатант ультрацентрифугировали при 140 тыс. g в течение 4 ч. Полученный осадок растворяли буферным раствором в 50 раз меньше исходного объема. Полученные антигены использовали для анализа полипептидного состава методом электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноблотинга, РДП.

Для получения гипериммунных сывороток вируссодержащий материал (штамм М-88 вируса ВМ с титром 10^5,0ТЦД_50/см ³) вводили ягнятам 2-3-месячного возраста в объеме 1-2 см³ интратрахеально и 2-3 см³ интрапульмонально каждые 3 дня в течение месяца. Для получения сыворотки отбор крови проводили каждые 7 дней и исследовали их активность в ИФА (набор фирмы ID Vet, Франция). При этом титр антител составил 1:80-1:160. Максимальный титр антител в ИФА получен на 14 сутки.

В отличие от перевиваемых и первичных культур клеток, используемых для изучения и репродукции вирусов - возбудителей медленных инфекций (висна-маеди, артрита- энцефалита коз) монослой штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) сохраняется до трех недель, что целесообразно при работе с исследуемыми патогенами, особенно полевыми изолятами вирусов с низким титром активности.

Источники информации

1. Инфекционная патология животных: в 2Т / Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 1911 с.

2. Сидельников Г.Д., Биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз: Дис.… канд. вет.наук 16.00.03 / Георгий Дмитриевич Сидельников - Покров, 2009. - 117 с.

3. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Н.Ф. Фомина.- М.: Колос, 1979. - 472 с.

4. Establishment and partial characterization of an ovine synovial membrane cell line obtained by transformation with Simian Virus 40 Т antigen / U.M. Costa, D. Reischak, J. da Silva, A.P. Ravazzolo // Journal of Virological Methods. - 2005. - Vol.128, Issues 1-2. - P. 72-78.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых антигенных препаратов. Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для научно-исследовательской и диагностической работы, обладающего пермиссивностью к лентивирусам мелких жвачных, пригодный для научно-исследовательской работы и конструирования новых антигенных препаратов. Штамм диплоидных клеток СМЯ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантантов в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Штамм клеток СМЯ чувствительна к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)). Штамм клеток СМЯ хранится в коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №64 и депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко под №82. 1 пр.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries СМЯ депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) под №82, используемый в вирусологических исследованиях.