СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ M.LEPRAE У БОЛЬНЫХ С РЕГРЕССОМ ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/561 

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано в качестве одного из критериев излеченности больных лепрой.

Известен способ выявления M.leprae в слизистой носа и кожных поражениях, который заключается в исследовании мазков из отделяемого полости носа, кожных скарификатов и биоптатов кожи. Мазки и гистологические срезы окрашивают по Циль-Нильсену и исследуют под световым микроскопом /Laboratory Techniques for Leprosy, WBO, 1987, Jeneva, pp. 166/.

Однако, известный способ малоэффективен при обследовании больных лепрой с регрессом болезни, получающих специфическое лечение более 5-8 лет, т.к. в этой стадии болезни в коже и слизистой микобактерии определяются крайне редко. Кроме того, осуществление известного способа - получение скарификатов и биоптатов кожи - процедура травматичная.

Известен способ обнаружения M.leprae в организме больного по выявлению ФГЛ-1 (специфического антигена M.leprae) в сыворотке крови Cho S.N., Hunter S. . V. , Geber R. H., Rea Т.Н., Brennan P.J. Quantitation of the phenolic glycolipid of Mycobacterium leprae and relevance to glycolipid antigenemia in leprosy. The Journal of Infections Diseases, 1986, v. 153, N 3, p.560-566.

Способ осуществляется следующим образом. Из вены берут 1-2 мл крови для получения 0,5-1 мл сыворотки. Из сыворотки экстрагируют липиды с последующей их очисткой на колонке с силиконовой кислотой, а затем в выделенных липидах с помощью ингибиционного варианта иммуноферментного анализа определяют ФГЛ-1 (фенольный гликолипид), используя моноклональные антитела к ФГЛ-1. Способ не обладает высокой точностью, т. к. ФГЛ можно обнаружить в сыворотке крови только при высокой бактериальной нагрузке M.leprae в организме больного, т. е. в активной стадии болезни; известный способ неприемлем для определения антигенов M.leprae в сыворотке больных с регрессом заболевания, потому что в этой стадии болезни они могут вообще отсутствовать в токе крови, т.к. бывают связаны в иммунные комплексы, которые фиксированы в тканях; известный способ трудоемкий и многоэтапный и осуществляется в течение 3-4 дней.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения группы риска рецидива у больных лепрой /патент N 2082979 авторов Дячины М.Н., Дегтярева О.В./.

Способ основан на определении в сыворотке крови антител к микобактериям лепры с помощью иммуноферментного анализа, используя в качестве тест-антигенов полусинтетический аналог видоспецифического антигена M.leprae (Dis-BSA) и нативный препарат из "озвученных" M.leprae (УЗД-M.leprae).

Способ позволяет судить о присутствии M.leprae в организме больного по показателям уровня антител в сыворотке крови к различным антигенам M.leprae. Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- недостаточную точность, связанную с ограниченными сорбционными возможностями полистирола;
- неспособность некоторых антигенов из состава УЗД-M.leprae по своим физико-химическим свойствам фиксироваться на поверхности полистирола, в результате чего в сыворотке крови не могут быть определены антитела к нефиксированным антигенам.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается в изобретении тем, что в сыворотке крови дополнительно определяют антитела к антигенам M.leprae, перекрестно реагирующим с антигеном M.avium в реакции встречного иммуноэлектрофореза и по наличию их в сыворотке крови судят о присутствии M.leprae в организме больных с регрессом заболевания.

Отличительной особенностью осуществления способа является использование метода встречного иммуноэлектрофореза и антигена УЗД-M.avium в качестве тест-антигена.

Серодиагностика лепры основана на выявлении в сыворотке крови антител к различным антигенным детерминантам M.leprae. В частности, иммуноферментным методом с помощью 2-х тест-антигенов M.leprae нативного (УЗД-М.leprae) и полусинтетического (Dis-BSA) удалось обнаружить серопозитивных лиц среди больных, находящихся на амбулаторном лечении, т.е. с регрессом лепры. Это позволило прогнозировать рецидив лепры задолго до появления клинических признаков и бактериоскопической позитивности у этой группы больных.

Известно, что M. leprae имеет общие антигены с M.avium. Один из общих антигенов M. leprae и M.avium имеет электрофоретическую подвижность α- глобулинов и при электрофорезе движется к аноду (+), а антитела к нему (гамма-глобулины) движутся к катоду (-). Это обуславливает возможность обнаружения результатов реакции (линий преципитации) во встречном иммуноэлектрофорезу. Авторами было показано, что в реакции встречного иммуноэлектрофореза сыворотки некоторых больных лепрой в стадии регресса реагируют с "озвученным" антигеном из M.avium. Используя эту тест-систему, авторам удалось дополнительно выявить 28 серопозитивных больных лепрой среди амбулаторной группы, которые на момент исследования были серонегативны в системе ИФА с антигенами УЗД-M.leprae и Dis-BSA.

Дальнейшее обследование показало, что у этих больных, как правило, наблюдались специфические осложнения лепрозного процесса - периферические полиневриты, остеомиелиты, нейротрофические язвы, оорхиты, иридоциклиты, гепатиты и т.д. - причиной которых были M.leprae, персистирующие во внутренних органах и периферических нервах.

Подтверждением этому явились результаты изучения секционного материала от бывших больных лепрой с регрессом заболевания: в мазках отпечатках и гистологических препаратах от серо-позитивных больных были обнаружены M.leprae, в материале от серонегативных больных M.leprae не обнаружены.

То есть, антитела к M.leprae являются маркерами возбудителя лепры, персистирующего во внутренних органах. Их определение в сыворотке крови позволяет оценить эффективность специфической химиотерапии и может быть одним из критериев излеченности больных.

Таким образом, авторами предлагается способ определения M.leprae у больных с регрессом заболевания по выявлению в сыворотке крови антител к антигенам M. leprae, перекрестно-реагирующим с M.avium во встречном иммуноэлектрофорезе, с использованием в качестве тест антигена M.avium. Способ позволяет дополнительно выявить серопозитивных лиц среди больных с регрессом лепры, которые в момент обследования серонегативны в реакции с другими антигенами M. leprae, и получить положительный эффект в виде повышения точности способа.

Предлагаемый способ позволяет выявить среди больных с регрессом лепры лиц с M.leprae персистирующими в органах и тканях (сформировать группу риска), изменить схемы лечения этим больным, использовать способ для определения критерия излеченности больных лепрой, провести эпид мероприятия в очаге проживания инфицированного больного.

Предлагаемый способ осуществляли следующим образом: Забор крови в объеме 0,15 мл производили из пальца с помощью скарификатора. Пробирку с кровью помещали в термостат (37^o х 1 час). После ретракции сгустка собирали сыворотку (40-50 мкл) и хранили при -20^oC до использования.

Тест-антиген УЗД-M. leprae получали из M.leprae, выделенных из органов животных с экспериментальной лепрой. Бакмассу разводили забуференным физраствором (pH-7,4) из расчета 50 мг на 1 мл и разрушали с помощью ультразвука на аппарате MSE-100 (при 18 кГц в течений 7 мин. дробно). Соникат центрифугировали 10000 об. в течение 40 мин. Надосадок хранили при -20^oC и использовали в качестве антигена после проверки белка по Лоури. Концентрация белка в антигене УЗД-M.leprae соответствовала 1-1,5 мг/мл.

Тест-антиген УЗД-M. avium получали из M.avium, выращенных на среде Сотона. Выращенную бакмассу трижды отмывали от культуральной среды физраствором путем центрифугирования (6000 об х 15 мин). Осадок бакмассы после отмывания разводили в забуференном физрастворе (pH-7,4) из расчета 50 мг бакмассы на 1 мл раствора и разрушали с помощью ультразвука на аппарате MSE-100 (при 18 кГц в течение 7 мин дробно). Соникат центрифугировали 10000 об х 40 мин. Надосадок хранили при -20^o и использовали в качестве антигена после проверки белка по Лоури. Концентрация белка в антигене УЗД-M.avium соответствовала 1,8-2,3 мг/мл.

Постановку встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) осуществляли на аппарате ПИЭФ-01, предназначенном для обнаружения в сыворотке крови антигена вирусного гепатита. -
Излагаемую сущность способа поясняем чертежом, где 1 - пластина держателя с гелем; 2 - лунки для образцов сывороток; 4 - лунки для тест-антигена, 3 - линии преципитации.

Готовили 1% гель из агара " Difco " на веронал-мединаловом буфере (ВМБ) (pH-8,4) и заливали пластину держателя (21 мл агара на 1 пластину), установленную на горизонтальной поверхности с "уровнем". После застывания в геле пробивали лунки, опуская на пластину с гелем укрепленный штамп. Образовывались 2 параллельных ряда лунок по 26 в каждом ряду (рис.1). Тест-антиген УЗД-M. leprae разводили ВМБ до 1:4, тест-антиген УЗД-M.avium до 1:8, Тест- сыворотку - до 1:8 (положительный контроль - сыворотка, содержащая антитела к общему антигену M.avium и M.leprae). В 1-ю лунку со стороны "антиген" заливали 20 мкл УЗД-M.leprae, во 2-ю и последующие лунки (по 26 включительно) заливали по 20 мкл УЗД-M.anium. в 1-ю и 2-ю лунки со стороны "антисыворотка" заливали по 20 мкл тест-сыворотки. В остальные лунки (с 3-ей по 26-ю) заливали исследуемые образцы сывороток (цельные). Пластину держателя с заполненными лунками устанавливали в электрофоретическую камеру, заливали в обе кювета по 45 мл ВМБ (pH-8,4), камеру включали в сеть. Режим электрофореза -30 в х 30 мин. После окончания электрофореза вынимали пластины держателя и оценивали результаты реакции при косом освещении на черном фоне.

Реакция ВИЭФ качественная, и ее оценивали по наличию линий преципитации (+) между антигеном и сывороткой или ее отсутствию (-). Образцы сывороток, содержащие антитела к общему антигену M.leprae и M.avium, образовывали линию преципитации. Если в сыворотках больных лепрой отсутствовали антитела к общему антигену M.leprae и M.avium), то линия преципитации не образовывалась. Наличие линий преципитации 1-1 и 2-2 на каждом планшете обязательно как "положительный" контроль. На рис.1 представлен вариант реакции, когда антитела обнаружены в образцах сывороток N 7, 10, 16, 19.

Антитела отсутствовали в сыворотках доноров (65 чел.), больных туберкулезом (34 чел.) и больных с острыми инфекциями (вирусные, кишечные, менингококковые) - 22 чел. Эти сыворотки были использованы в качестве "отрицательного" контроля.

Способ апробирован на 93 больных лепрой с регрессом заболевания, находящихся на амбулаторном лечении в Институте по изучению лепры (г. Астрахань) и в Каракалпакском республиканском лепрозории за период с 1995 по 1997 гг. Ниже приводятся результаты апробации.

Изложенная сущность изобретения поясняется табл. 1 и 2 в конце описания и примерами 1, 2.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что у 30% больных лепрой с регрессом заболевания и бактериоскопически негативных антитела к антигенам M. leprae обнаруживаются только в реакции ВИЭФ с помощью антигенов M.avium, перекрестно-реагирующих с M.leprae. Это свидетельствует о дополнительном выявлении среди этой группы больных лиц, у которых возбудитель лепры персистирует во внутренних органах или периферических нервах.

Пример 1.

Больная Х-ва А., 1927 г.р. (и/б N 3210) больна лепрой с 1950 г. Выписана на амбулаторное лечение в 1961 г. с диагнозом: Лепроматозный тип лепры, регресс заболевания. Осложнение - хронический лепрозный гепатит. С 1990 г. периодически поступала в клинику НИИ по изучению лепры по поводу лечения осложнений лепры. Клинически у больной наблюдается регресс заболевания: нет активных проявлений на коже, в скарификатах и биоптатах кожи отсутствуют M. leprae, БИН=0.

Для постановки серологических реакций ИФА и ВИЭФ забор крови у больной производили из пальца с помощью скарификатора в объеме 0,15 мл. Пробирку с кровью помещали в термостат (37 х 1 час). После ретракции сгустка собирали сыворотку (40 мкл) и использовали для ИФА и ВИЭФ. Постановку Встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) осуществляли на аппарате ПИЭФ-01.

Готовили 1% гель из агара "Difco" на веронал-мединаловом буфере (ВМБ) (pH-8,4) и заливали пластину держателя (21 мл агара на 1 пластину), установленную на горизонтальной поверхности с "уровнем". После застывания геля пробивали лунки, опуская на пластину с гелем укрепленный штамп. Образовывались 2 параллельных ряда лунок по 26 в каждом ряду. Тест-антиген УЗД-M.leprae разводили ВМБ до 1: 4, тест-антиген УЗД-M.avium - до 1:8) тест-сыворотку (положительный контроль) - до 1:8 - сыворотка, содержащая антитела к общему антигену M.leprae и M.avium). В 1-ю лунку со стороны "антигена" заливали 20 мкл УЗД-M.leprae во 2-ю и последующие лунки (по 26 включительно) заливали по 20 мкл УЗД-M.avium. в 1-ю и 2-ю лунки со стороны "антисыворотки" заливали по 20 мкл тест-сыворотки. В 3, 4, 5, 6, 7-ю лунки заливали по 20 мкл образцов сывороток от больной Х-ой (3460, 3608, 3841, 4003, 4647). В остальные лунки (с 8-й по 26-ю) заливали другие исследуемые образцы сывороток. Пластины держатели с заполненными лунками устанавливали в электрофоретическую камеру, заливали в обе кюветы по 45 мл ВМБ (pH-8,4), камеру включали в сеть. Режим электрофореза - 30 в х 30 мин. После окончания электрофореза вынимали пластины держателя и оценивали результаты реакции при косом освещении на черном фоне. Между лунками 1-1 и 2-2 (положительный контроль), а также лунками 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 7-7, образовались линии преципитации, свидетельствующие о наличии в этих образцах сывороток антител к общему антигену M.leprae и M.avium.

Серологические показатели приведены ниже:
Пример 1 показывает, что у больной Х-ой в течение 6 лет в сыворотке крови с помощью ВИЭФ определяются антитела к антигенам M.leprae, перекрестно реагирующим с M. avium. Это связано с персистенцией M.leprae в печени, что подтверждается наличием у больной Хронического лепрозного гепатита.

Пример 2.

Больная М-ян, 1938 г.р. (и/б N 3387) больна лепрой с 1952 г. Выписана на амбулаторное лечение в 1966 г. с диагнозом: Лепроматозный тип лепры, регресс заболевания. Осложнение - специфический полиневрит с чувствительными и двигательными трофическими нарушениями. Хронический остеомиелит костей стоп. С 1989 г. больная периодически госпитализируется в клинику НИИ по изучению лепры по поводу обострения специфических невритов. На коже отсутствовали активные проявления лепры, в скарификатах и биоптатах кожи M.leprae не обнаруживались, БИН=0. Постановка ВИЭФ осуществлялась так же, как указано в примере 1. Серологические показатели приведены ниже:
Пример 2 показывает, что у больной М-ян в течение 4 лет в реакции ВИЭФ в сыворотке крови обнаруживались антитела к антигенам M.leprae перекрестно реагирующим с антигеном M.avium, в то время как в ИФА эти образцы сывороток были серонегативные. Определяемые в ВИЭФ антитела к M.leprae связаны с персистенцией M. leprae в периферических нервах, что подтверждается наличием у больной специфического полиневрита.

В таблице 2 показано, что у больных с активной лепрой (1 группа и/б N 3777, 3228, 3732, 3261) - положительный контроль), на коже - активные проявления лепры, больные-бактериоскопически позитивны, в сыворотке крови - высокий уровень антител ко всем используемым антигенам в ИФА и ВИЭФ. Эти показатели соответствуют результатам анализа секционного материала. M.leprae обнаружены в различных внутренних органах и периферических нервах.

Во 2-ой группе (и/б N 1596, 2462, 1926, 2669, 3701) представлены больные лепрой со стойким регрессом (срок лечения 10-15 лет), у которых отсутствуют активные проявления на коже, в скарификатах и биоптатах кожи не обнаруживаются M. leprae в течение 5 лет; в сыворотке крови не определяются антитела к антигенам M. leprae. В секционных препаратах M.leprae не найдены. Т.е. отсутствие антител к M. leprae в сыворотке крови больных этой группы, подтверждается отсутствием M.leprae в секционном материале (группа отрицательного контроля).

В 3-й группе (и/б N 3463, 3185, 3076, 3628, 1896, 3485) также представлены больные с регрессом лепры (срок лечения 10-15 лет), у которых периодически наблюдались обострения лепрозных осложнений (невриты, гепатиты, иридоциклиты, орхиты). Активных проявлений на коже не наблюдалось более 5 лет. M.leprae в коже также не находили, но эти больные были серопозитивны в течение 3-4 лет: антитела к M.leprae обнаруживались либо в одной, либо в 2-х серологических реакциях; в секционных препаратах M.leprae обнаружены.

Данные, приведенные в таблице 2, подтверждают, что антитела к различным антигенам M. leprae служат маркерами M.leprae, персистирующих в различных органах и тканях. У 2-х больных (3 группа и/б N 3185, 3628) этими маркерами были антитела только к антигенам M.avium, в ВИЭФ, т.к. в ИФА показатели уровня антител были либо отрицательными, либо в пределах фоновых значений.

Предлагаемым изобретением достигается повышение точности способа, которое заключается в дополнительном выявлении среди больных лепрой с регрессом заболевания лиц, инфицированных M.leprae, по обнаружению у них в сыворотке крови антител к антигенам M.leprae, перекрестно-реагирующим с M.avium.

Предлагаемый способ может быть также использован как один из критериев излеченности больных лепрой. Осуществление предложенного способа поможет в коррекции проводимой химиотерапии у лиц с очагами персистенции M.leprae, а также в проведении эпидмероприятий в очаге проживания инфицированного больного.

Предложенный способ может быть осуществлен в противолепрозных учреждениях системы здравоохранения, а также в научных и клинических лабораториях, занимающихся проблемами туберкулеза и микобактериозов.

Изобретение относится к медицине, в частности, может быть использовано в качестве одного из критериев выявления излеченности больных лепрой. Способ основан на определении в сыворотке крови больных антител к антигенам M. Leprae с помощью иммуноферментного анализа. Дополнительно в сыворотке определяют антитела к антигенам M.leprae, перекрестно-реагирующим с антигенами M. aviun, с помощью встречного иммуноэлектрофореза. И при наличии в сыворотке крови указанных антител выявляют присутствие M.leprae в организме больного с регрессом заболевания. Способ позволяет повысить точность выявления больных с регрессом заболевания, инфицированных M.leprae, способствует коррекции проводимой химиотерапии у лиц с очагами персистенции, а также проведению эпидмероприятий в очаге проживания инфицированного больного. 2 табл., 1 ил.

Способ определения M.leprae у больных с регрессом заболевания, состоящий в определении в сыворотке крови антител к различным антигенам M.leprae в иммуноферментном анализе, отличающийся тем, что в сыворотке крови дополнительно определяют антитела к антигенам M.leprae, перекрестно-реагирующим с антигенами M. avium во встречном иммуноэлектрофорезе, и по наличию их в сыворотке крови судят о присутствии M.leprae в организме больных с регрессом заболевания.