СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ACTIVIN С ПОМОЩЬЮ НОГГИН2 Российский патент 2009 года по МПК C07K14/475 C07K14/495 C07K16/22 A61K38/18 A61P43/00 

Область изобретения

Данное изобретение относится к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белков надсемейства TGF-β.

Предшествующий уровень техники

Надсемейство трансформирующего фактора роста Р (TGF-P) включает в себя множество факторов роста, обладающих общими структурными мотивами. Данные белки вовлечены в широкий спектр биологических процессов, таких как процессы клеточной и тканевой дифференцировки в ходе эмбрионального развития и заживления ран, восстановление и реконструкции костной ткани во взрослом организме. Идентифицирован ряд белков межклеточного матрикса, являющихся антагонистами различных представителей надсемейства TGF-β (например, белков костного морфогенеза, BMP) и играющих важную роль в процессах клеточной дифференцировки и развития (Balemans and Van Hul, Dev Biol. (2002) 250 (2):231-250; Avsian-Kretchmer and Hsueh, Mol Endocrinol. (2004) 18(I):1-12). К антагонистам BMP относятся, например, белки хордин, вентроптин, ноггин, церберус и фоллистатин.

Например, белки церберус и ноггин позвоночных индуцируют формирование структур головы в передней эктодерме эмбрионов позвоночных. Белок ноггин способен также изменять дифференцировку мезодермальных зачатков из вентральных зачатков, таких как кровь и мезенхима, в дорзальные зачатки, такие как мышца или хорда, или дифференцировку эпидермальных зачатков в нейральные зачатки. Функции хордина сходны с функциями ноггин1, отражая сходный механизм действия этих белков как антагонистов BMP.

Антагонисты факторов роста из надсемейства TGF-β являются важными фармацевтическими, клиническими и лабораторными инструментами для регуляции клеточной дифференцировки и терапевтического вмешательства.

Недавно у позвоночных был описан новый гомолог белка ноггин, названный ноггин2 (Fletcher et al., Gene Expr Patterns. 2004, v. 5(2), pp.225-230). Было показано, что ген ноггин2 имеет дифференциальный характер экспрессии в ходе развития Xenopus. Однако функция ноггин2 не исследована. Настоящее изобретение относится к функции ноггин2.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения открыли, что ноггин2 играет роль в регуляции клеточной дифференцировки и является антагонистом некоторых представителей надсемейства TGF-P. При этом спектр и характер действия ноггин2 отличны от таковых ноггин1 (ранее "ноггин"). В частности, в отличие от ноггин1, ноггин2 не индуцирует развитие мышечной ткани из эмбриональной вентральной мезодермы. Кроме того, он может препятствовать хорошо известной активности ноггин1 в отношении индукции развития мышц. В то же время, подобно ноггин1, ноггин2 может индуцировать развитие нервной ткани из эмбриональной эктодермы. Таким образом, ноггин2 обладает уникальной избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани.

Выявленная способность ноггин2 препятствовать дифференцировке мышечной ткани объясняется его способностью ингибировать общую дифференцировку эмбриональной мезодермы благодаря взаимодействию с иным (более широким) спектром факторов из надсемейства TGF-β. Наряду с ингибированием эпидермализующей активности ВМР2, ВМР4 или ВМР7, которая, как известно, также ингибируется ноггин1, ноггин2 обладает способностью ингибировать активность такого индуктора эмбриональной мезодермы, как activin.

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, в которых используется ноггин2 или кодирующая его нуклеиновая кислота.

В предпочтительном осуществлении настоящее изобретение относится к способу снижения или блокирования активности специфичных для ноггин2 мишеней (например, ВМР2, ВМР4, ВМР7, activin или их сочетания) в организме, ткани или клетке, предусматривающему введение ноггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности специфичных для ноггин2 мишеней посредством препятствования связыванию указанных мишеней или их фрагментов со специфическими белковыми рецепторами.

В предпочтительном осуществлении указанный способ и композиции используются для модификации клеточной дифференцировки, где указанный способ предусматривает приведение клетки или окружающей клетку среды в контакт с белком ноггин2 в таких условиях, когда ноггин2 специфически взаимодействует со своими мишенями - компонентами среды и/или клеточной поверхности, для модификации клеточной дифференцировки.

В одном предпочтительном осуществлении используется экзогенный белок ноггин2; в другом предпочтительном осуществлении используется экспрессирующая конструкция, содержащая кодирующую ноггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора. В этом осуществлении способ изменения клеточной дифференцировки предусматривает создание экспрессирующей конструкции, содержащей кодирующую ноггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора; введение указанной экспрессирующей конструкции в клетку для экспрессии ноггин2 или функционального химерного белка, содержащего ноггин2, где экспрессия ноггин2 или указанного химерного белка приводит к изменению клеточной дифференцировки.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлено различие между эффектами ноггин1 и ноггин2 на дифференцировку нервной и мышечной тканей в эмбрионах Xenopus laevis и их тканевых эксплантатах. (В-И) сигнал гибридизации 1 л situ показан черным.

(А, Б). Вентральные микроинъекции 40 пг синтетической мРНК гена ноггин1 в зародыши X. laevis на ранних стадиях развития приводят к формированию дополнительной оси тела (черная стрелка указывает основную ось тела, серая стрелка указывает дополнительную ось тела), в то время, как микроинъекции такого же количества синтетической мРНК ноггин2 приводит к формированию грибообразного фенотипа (А: 80%, всего - 68 зародышей из 85; Б: 90%, всего - 68 зародышей из 75).

(В-Ж). In situ гибридизация контрольных зародышей (слева на каждой их фотографий) и зародышей, микроинъецированых мРНК ноггин2 с пробами мРНК приведенных генетических маркеров показывает усиление нейральной (В, Г) и подавление эпидермальной (Д) и мезодермальной (Е, Ж) дифференцировок. Сигнал показан черным.

(З). Эксплантаты вентральной маргинальной зоны (VMZ) зародышей, микроинъецированных вентрально РНК ноггин1 удлиняются к концу нейруляции благодаря дифференцировке скелетной мускулатуры.

(И). Эксплантаты вентральной маргинальной зоны (VMZ) зародышей, микроинъецированных вентрально РНК ноггин2 к концу нейруляции сохраняют округлую форму.

(К). Схема экспериментов с эксплантатами эктодермы анимальной области зародышей (анимальные шапочки - АС) и эксплантатов вентральной маргинальной зоны зародышей (VMZ).

(Л). Обратная транскрипция - ПЦР анализ проб тотальной РНК эксплантатов эктодермы анимальной области зародышей и эксплантатов вентральной маргинальной зоны зародышей, микроинъецированных мРНК ноггин1 и ноггин2 с праймерами к нейроэктодермальным (NCAM, Xanf-1), эпидермальным (keratin), мышечным (α-actin), постериорному мезодермальному (brachyury) и эндомезодермальному (cerjberus) молекулярным маркерам и Ef-1α в качестве контроля количества мРНК. Ноггин1 и ноггин2 активируют экспрессию нейральных маркеров (NCAM, Xanf-1) и подавляют экспрессию эпидермального (keratin), в то время только мРНК ноггин1 обнаруживает способность активировать экспрессию мышечного молекулярного маркера α-actin в эксплантатах вентральной маргинальной зоны.

На фиг.2 представлено различие между эффектами ноггин1 и ноггин2 на экспрессию генов jbrachyury, BF-1 и Pax-6 и приведены анализы способности белка ноггин2 связываться с ВМР-4 и activin. (А-Е) - результаты гибридизации in situ тотальных препаратов эмбрионов Xenopus laevis с зондами к соответствующим генам (сигнал гибридизации in situ показан черным); (А'-Е') - те же эмбрионы показаны под ультрафиолетовым освещением, что позволяет визуализировать микроинъецированные клетки, содержащие помимо мРНК метку - флюоресцеин-лизин-декстран (FLD).

(А, А'). Подавление экспрессии мезодермального молекулярного маркера (brachyury) у зародышей, микроинъецированных мРНК ноггин2. А' - зеленый флуоресцентный краситель показывает распределение микроинъецированного материала.

(Б, Б'). Экспрессия мезодермального молекулярного маркера (brachyury) у зародышей, микроинъецированных мРНК ноггин1 не обнаруживают изменений по сравнению с контрольным зародышем (стрелка).

(В, В', Д, Д'). Формирование дополнительной оси тела у зародышей, микроинъецированных 2-5 нг мРНК ноггин2 в один из вентральных бластомеров. Наличие экспрессии молекулярных маркеров BF-1 и Pax-6 указывает на наличие в дополнительных осях переднеголовных и глазных структур.

(Г, Г', Е, Е'). Дополнительные оси тела, формирующиеся при микроинъекциях 40 нг мРНК ноггин1 в один из вентральных бластомеров зародыша не содержат переднеголовных и глазных структур.

(Ж). Белок ноггин2 проявляет способность связывать молекулы костного морфогенетического белка (BMP) и молекулы activin. Подробное описание экспериментов приведено в тексте примеров 4 и 5.

(З). Белок ноггин2 проявляет способность ингибировать фосфорилирование внутриклеточных передатчиков сигналов BMP activin - белков Smad1 и Smad2 соответственно. Подробное описание экспериментов приведено в тексте примеров 4 и 5.

Подробное описание изобретения

Используемый здесь термин "ортолог" обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, являющийся функциональной копией полипептида или белка другого вида. Различия последовательностей ортологов являются результатом видообразования.

Используемый здесь термин "гомолог" или "гомология" представляет собой термин, применяющийся в данной области для описания родства нуклеотидной или белковой последовательности другой нуклеотидной или белковой последовательности, определяемого посредством степени идентичности и/или подобия между указанными сравниваемыми последовательностями.

Как обобщено выше, раскрыты способы изменения активности определенных представителей надсемейства TGF-J3, а также композиции, содержащие белок ноггин2, кодирующую его нуклеиновую кислоту или антитела против ноггин2 для применения в них. Указанные способы и композиции для их практического применения могут быть использованы в ряде исследовательских, диагностических или терапевтических приложений, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров ингибирование или уменьшение воспаления; регуляцию реконструкции кости во взрослом скелете; профилактику и лечение связанных с BMP и activin нарушений у животных, в частности людей; исследование и лечение сердечных заболеваний и неврологических нарушений.

Настоящее изобретение относится к применению конкретной функции ноггин2. На примере белка ноггин2 из Xenopus laevis с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, авторы открыли, что ноггин2 играет роль в регуляции дифференцировки клеток и по действию и особым мишеням для связывания отличен от ноггин1 и других известных антагонистов факторов роста, принадлежащего к надсемейству TGF-P. В отличие от ноггин1 ноггин2 подавляет общую дифференцировку эмбриональной мезодермы, ингибируя действие индуктора мезодермы - activin.

В то же время, подобно ноггин1, ноггин2 индуцирует развитие нервной ткани из эмбриональной эктодермы. Таким образом, ноггин2 обладает уникальной избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани. Выявленная способность ноггин2 препятствовать дорзализующей активности ноггин1 является результатом его способности связываться с некоторыми отличными от ВМР2, ВМР4 или ВМР7, достоверно связывающимися с ноггин1, представителями надсемейства TGF-β. В частности, дополнительными факторами TGF-β, связывающимися с ноггин2, являются activin и родственные ему белки, необходимые для индукции мышц из эмбриональной мезодермы.

Используемый здесь термин "ноггин2" означает белок, обладающий единственной и избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани, связывающийся со специфичными для ноггин2 мишенями для связывания выбранными из группы, состоящей из ВМР2, ВМР4, ВМР7 и activin или их сочетания, и являющийся гомологом и ортологом белков ноггин2, выбранных из группы, состоящей из ноггин2 Xenopus laevis; ноггин2 Xenopus tropicalis; ноггин2 Fugu rubripes; ноггин2 Gallus gallus (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8). Ноггин2 млекопитающих, включая человеческий ноггин2, представляет собой особый интерес.

Специфичную для ноггин2 активность или функцию можно определить посредством известных подходов клеточной биологии в системах in vitro или in vivo, например, анализы связывания in vitro, анализы в клеточной культуре, у животных (например, иммунный ответ, генная терапия, трансгенные животные и т.д.) и т.п. Анализы связывания включают в себя любой анализ, где оценивают специфическое молекулярное взаимодействие ноггин2 с мишенью для связывания. Мишень для связывания может представлять собой природную мишень для связывания или неприродную мишень для связывания, такую как специфичный иммунный белок, например антитело. Как правило, специфичность связывания оценивают посредством биологического анализа (например, способность к индукции нервной ткани из инъецированной эмбриональной эктодермы) или определения константы связывания ноггин2 с его мишенями из надсемейства TGF-β и т.д.

Под гомологом белка подразумевают белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере приблизительно на 68%, как правило, по меньшей мере приблизительно на 75% и наиболее часто по меньшей мере приблизительно на 85% идентичен известным аминокислотным последовательностям ноггин2, приведенным в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, как определено с применением алгоритма MegAlign, DNAstar clustal algorithm, как описано в D.G. Higgins and P.M. Sharp, "Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer", CABIOS, 5 pp.151-3 (1989) (с применением параметров кратности 1, штрафа за пропуск 3, окна 5 и сохраненными диагоналями 5). Во многих осуществлениях представляющие интерес гомологи обладают гораздо большей идентичностью последовательности, например, 90% (например, 92%, 93%, 94%) или выше, например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, особенно для последовательности аминокислот, формирующей функциональные области белка.

Также представляют интерес белки, в значительной степени идентичные белкам ноггин2, с аминокислотными последовательностями SEQ ID №№2, 4, 6, 8, где под значительной идентичностью подразумевают то, что аминокислотная последовательность белка идентична с последовательностью указанного белка по меньшей мере приблизительно на 68%, как правило, по меньшей мере приблизительно на 75% и наиболее часто по меньшей мере приблизительно на 80%, где в некоторых случаях идентичность может составлять более чем, например, 85%, 90%, 95% или более.

Представляющие интерес белки включают в себя встречающиеся в природе белки и рекомбинантные белки, содержащие аминокислотную последовательность ноггин2 или его функциональные белковые домены, обладающие определимой анализом специфической активностью ноггин2. Таким образом, белки могут представлять собой делеционные мутанты природных белков ноггин2, и их можно получать в виде гибридных продуктов, содержащих полипептиды ноггин2 или его функциональные белковые домены. Представляющие интерес фрагменты являются полипептидами, как правило, длиной по меньшей мере приблизительно 30 аминокислот, как правило, длиной по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, предпочтительно длиной по меньшей мере приблизительно от 75 до 100 аминокислот и могут составлять в длину до 300 аминокислот или более, но, как правило, не превосходят длины 250 аминокислот, где фрагмент содержит участок аминокислотной последовательности, идентичный рассматриваемому белку, длиной по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, а как правило, по меньшей мере 45 аминокислот, а во многих осуществлениях по меньшей мере 50 аминокислот. В некоторых осуществлениях рассматриваемые полипептиды составляют в длину приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 200 или приблизительно 250 аминокислот, вплоть до полноразмерного белка. Представляющие интерес фрагменты сохраняют все или по существу все специфические функции белка дикого типа.

Также представляют интерес белки, являющиеся производными или мутантами встречающихся в природе белков со специфической активностью ноггин2. Мутанты и производные могут сохранять биологические свойства белков дикого типа (например, встречающихся в природе) или могут обладать биологическими свойствами, отличными от таковых белков дикого типа. Термин "биологическое свойство" белков по настоящему изобретению относится к биохимическим свойствам, таким как стабильность in vivo и/или in vitro (например, период полураспада); скорость созревания, способность к агрегации или к формированию олигомеров и другим таким свойствам, но не ограничен ими. Мутации включают в себя замены отдельных аминокислот, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот, укорочения или удлинения на N-конце, укорочения или удлинения на С-конце и т.п.

Также интерес представляет кодирующая ноггин2 нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: I, 3, 5, 7; нукленовых кислот, в значительной степени идентичных указанным нуклеиновым кислотам и их мутантам, производным и гомологам. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ноггин2 млекопитающих (например, человеческий ноггин2), представляют собой особый интерес.

Под гомологом нуклеиновой кислоты подразумевают нуклеиновую кислоту, идентичную соответствующей нуклеотидной последовательности по меньшей мере приблизительно на 30%, а предпочтительно - приблизительно на 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или выше, в т.ч. на 75%, 80%, 85%, 90% и 95% или выше. Контрольная последовательность составляет в длину, как правило, по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов, более часто - по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов и может достигать длины полной последовательности, подлежащей сравнению. Сходство последовательностей рассчитывают, основываясь на контрольной последовательности. В данной области известны такие алгоритмы для анализа последовательности, как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp.403-10 (1990) (например, с применением значений по умолчанию, т.е., параметров w=4 и Т=17).

Источником гомологичных нуклеиновых кислот и белка может являться любой вид растений или животных, или последовательность можно целиком или частично синтезировать, включая в нее аналоги нуклеиновых кислот.

Мутанты или производные белков и нуклеиновых кислот ноггин2 можно образовывать с применением стандартных способов молекулярной биологии к матричной нуклеиновой кислоте, кодирующей белок ноггин2, посредством изменения, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов матричной последовательности или их сочетания, для образования варианта матричной нуклеиновой кислоты. Замены, добавления или делеции можно вносить любым известным в данной области способом (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123 и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.15.3-15.108), представляющим собой ПЦР с ошибками, перестановку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборочный ПЦР, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных участков (GSSM), перестановку искусственным лигированием (SLR) или их сочетание.

Замены, добавления или делеции также можно вводить способом, предусматривающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с применением модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез с применением содержащей урацил матрицы, мутагенез с применением разрыва дуплекса, мутагенез с применением восстановления точечных несоответствий, мутагенез с применением штамма-хозяина с недостаточностью системы восстановления, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, мутагенез посредством делеции, мутагенез с применением рестрикции-отбора, мутагенез с применением рестрикции-очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерной нуклеиновой кислоты и их сочетание.

Кроме того, могут быть получены вырожденные варианты кодирующих белки ноггин2 нуклеиновых кислот. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот содержат замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же аминокислоты. Конкретно, вырожденные варианты нуклеиновых кислот получают для усиления их экспрессии в клетке-хозяине. В данном осуществлении кодоны нуклеиновой кислоты, не являющиеся предпочтительными или менее предпочтительные в генах клетки-хозяина замещают наиболее представленными в кодирующих последовательностях клетки-хозяина кодонами, где указанные замещенные кодоны кодируют ту же аминокислоту.

Производные также можно получать с применением стандартных способов, включающих в себя изменение РНК, химические модификации, посттрансляционные и посттранскрипционные модификации и т.п. Например, производные можно получать с применением таких способов как изменение профиля фосфорилирования или гликозилирования или ацетилирования или липидизации или с применением различных типов расщепления зрелых форм и т.п.

Представляющие интерес белки и фрагменты являются выделенными, т.е. существуют вне природной среды. Рассматриваемые белки и белковые домены можно синтезировать или получать посредством рекомбинантных технологий или выделять из их природной среды. Для биохимического синтеза, молекулярной экспрессии и очистки указанных композиций существует множество молекулярных и биохимических способов, см., например Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).

В предпочтительных осуществлениях белки по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантные белки, полученные с помощью стандартных подходов с применением кодирующей ноггин2 нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: I, 3, 5 или 7.

Упоминаемая здесь молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулы ДНК, такие как молекулы геномной ДНК или молекулы кДНК или молекулы РНК, такие как молекулы мРНК. Конкретно, указанные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы кДНК с открытой рамкой считывания, кодирующие белок ноггин2 по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и способны в подходящих условиях экспрессироваться в качестве активного ноггин2 или функционального домена ноггин2 по настоящему изобретению.

Представляющая интерес геномная последовательность может содержать нуклеиновую кислоту, находящуюся между инициирующим кодоном и стоп-кодоном, как определено в перечисленных последовательностях, включающую в себя все интроны, в норме присутствующие в исходной хромосоме. Представляющая интерес геномная последовательность может включать в себя 5'- и 3'-нетранслируемые области, находящиеся в зрелой мРНК, а также специфические транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры и т.д., включая в себя приблизительно 1 т.п.н., но возможно больше, фланкирующей геномной ДНК или на 5'- или на 3'-конце транскрибируемой области.

Рассматриваемые нуклеиновые кислоты можно выделять и получать в существенно очищенной форме. Термин "существенно очищенная форма" означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, как правило - по меньшей мере на 90% чистыми и, как правило, являются "рекомбинантными", т.е. фланкированы одним или несколькими нуклеотидами, с которыми они в норме не ассоциированы в природной хромосоме в их природном организме-хозяине.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, соответствующие кДНК, полноразмерные гены и конструкции можно получать искусственно посредством различных протоколов, известных специалистам в данной области. Соответствующие конструкции нуклеиновых кислот очищают с применением стандартных способов рекомбинантных ДНК, например, как описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по правилам, описанным, например, в United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research.

Также интерес представляют химерные белки, содержащие ноггин2 или его фрагменты, слитые, например, с последовательностью деградации, сигнальным белком или любым белком или полипептидом, представляющим интерес. Слитые белки могут содержать, например, белок ноггин2 и второй полипептид ("партнер по слиянию"), объединенные в одну рамку считывания на N-конце и/или С-конце полипептида ноггин2. Партнеры по слиянию включают в себя в качестве неограничивающих примеров полипептиды, способные связывать антитела, специфичные к партнеру по слиянию (например, эпитопные метки), антитела или их связывающие домены, полипептиды, обеспечивающие каталитическую функцию или индукцию клеточного ответа, лиганды или рецепторы или их миметики и т.п. В таких слитых белках партнер по слиянию, как правило, ассоциирован с частью гибридного белка, являющейся белком ноггин2, неприродным способом и, как правило, не является белком ноггин2 по настоящему изобретению или их производным/фрагментом. Также интерес представляют нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные выше гибридные белки.

Также раскрыты вектор и другие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую ноггин2 нуклеиновую кислоту. Применимые векторы включают в себя вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и их применяют для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в подходящем хозяине. Выбор подходящего вектора хорошо известен специалисту в данной области, а многие такие векторы имеются в продаже. Для получения конструкций частичную или полноразмерную нуклеиновую кислоту встраивают в вектор, обычно посредством присоединения ДНК-лигазой к расщепленному ферментом рестрикции участку в векторе. Альтернативно, желательную нуклеотидную последовательность можно встраивать посредством гомологичной рекомбинации in vivo, как правило, посредством присоединения к вектору по бокам желаемой нуклеотидной последовательности областей гомологии. Например, области гомологии добавляют посредством лигирования нуклеотидов или посредством полимеразной цепной реакции с применением праймеров, содержащих область гомологии и часть желаемой нуклеотидной последовательности.

Также раскрыты экспрессирующие кассеты или системы, в числе прочего применяемые для получения белка ноггин2 или его гибридного белка или для репликации молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Экспрессирующая кассета может существовать в качестве внехромосомного элемента или ее можно интегрировать в геном клетки как результат введения указанной кассеты в клетку. Для экспрессии продукт гена, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, экспрессируют в любой подходящей экспрессирующей системе, включая, например, бактериальные, дрожжевые системы, системы насекомых, амфибий или млекопитающих. В экспрессирующем векторе нуклеиновую кислоту по изобретению функционально связывают с регуляторной последовательностью, которая может содержать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Способы получения экспрессирующих кассет или систем, способных экспрессировать желаемый продукт, хорошо известны специалистам в данной области.

Клеточные линии, стабильно экспрессирующие ноггин2, можно отобрать посредством хорошо известных в данной области способов (например, совместной трансфекцией с селективным маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, обеспечивающим идентификацию и выделение трансфицированных клеток, содержащих интегрированный в геном ген).

Описанные выше экспрессирующие системы можно применять у прокариотических или эукариотических хозяев. Для получения белка можно использовать такие клетки-хозяева как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами или клетки высших организмов, таких как позвоночные, например клетки COS7, НЕК293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.

Когда для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению применяют любые из указанных выше клеток-хозяев или другие применимые клетки-хозяева или организмы-хозяева, образующиеся в результате реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид подпадают под объем изобретения как продукт клетки-хозяина или организма-хозяина. Продукт можно выделить любыми известными в данной области подходящими способами.

Также раскрыты антитела, специфично связывающиеся с ноггин2 по настоящему изобретению. Применимые антитела можно получать с применением известных в данной области способов. Например, поликлональные антитела можно получать, как описано в Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, а моноклональные антитела можно получать, как описано в Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3rd edition, (1996) Academic Press. Также представляют интерес гибридные антитела, включающие в себя гуманизированные антитела, а также одноцепочечные антитела и такие фрагменты антител как Fv, F(ab')₂ и Fab.

Ноггин2, а также другие описанные выше компоненты настоящего изобретения находят применение во множестве различных приложений, включающие в себя применение в качестве иммуногенов, мишеней в скринирующих анализах, биологически активных веществ для модуляции клеточного роста, дифференцировки и/или функционирования и т.д.

В предпочтительном осуществлении настоящее изобретение относится к способу снижения или ингибирования активности специфичных для ноггин2 мишеней (например, ВМР2, ВМР4, ВМР7, activin, nodal или их сочетания), предусматривающему введение ноггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве достаточном для ингибировании или снижения активности специфичных для ноггин2 мишеней посредством препятствия связыванию указанных мишеней или их фрагментов со специфическими белковыми рецепторами.

В предпочтительном осуществлении представленные способы и композиции используются для модификации клеточной дифференцировки. В частности, способ модификации клеточной дифференцировки предусматривает приведение клетки или окружающей клетку среды в контакт с белком ноггин2 в таких в условиях, когда ноггин2 специфически взаимодействует со своими мишенями - компонентами среды и/или клеточной поверхности, для осуществления изменения клеточной дифференцировки.

В одном предпочтительном осуществлении используется экзогенный белок ноггин2; в другом предпочтительном осуществлении используется экспрессирующая конструкция, содержащая кодирующую ноггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора. Белок ноггин2 может быть добавлен в среду культивирования in vitro и физиологические жидкости, такие как кровь, синовиальная жидкость и т.д. Белок можно также вводить или экспрессировать в конкретных популяциях клеток любым подходящим способом, таким как микроинъекция, зависимая от промотора экспрессия рекомбинантного фермента, целенаправленная доставка липидных частиц и т.д. Данные способы можно применять для снижения нежелательного остеогенеза, ингибирования роста клеток, требующего морфогенетического белка (например, зависимые от BMP нейробластомы и глиомы), регулирования образования и роста хряща, изменения зависимых от морфогена направления развития/дифференцировки клеток в культуре, таких как клетки для трансплантации или инфузии и т.д. Так как ноггин2 обуславливает активность в отношении индукции нервной ткани, он может быть применим для лечения периферических нейропатий при росте спинного мозга и отростков чувствительных нейронов, например, его можно включать в терапевтическое лечение для регенерации отростков нейронов после инсультов, повреждения головного мозга, вызванного травмами головы, и паралича, вызванного травмами спинного мозга. Применение также может состоять в лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, посредством стимуляции отростков нейронов. Дополнительные применения могут включать в себя восстановление рассеченных аксонов, что часто происходит в очагах повреждения при рассеянном склерозе.

Как антагонист ряда факторов роста (например, ВМР2, ВМР4, ВМР7, activin или их сочетания) ноггин2 или его фрагмент находит применение в качестве супрессора активности этих факторов, например морфогенетического костного белка (BMP), activin или их ортологов. Предпочтительно, изобретение относится к способу противодействия функционированию указанной специфической мишени, предусматривающему приведение указанной мишени в контакт с белком ноггин2 или его фрагментом. Способ по изобретению осуществляют в условиях, когда ноггин2 или его фрагмент связываются со специфической мишенью. В качестве антагониста BMP ноггин2 может быть применим для профилактики или лечения связанных с BMP нарушений у животных, в частности у людей. Например, ноггин2 может быть использован для лечения заболеваний или нарушений, которые включают в себя в качестве неограничивающих примеров прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию (FOP), а также для лечения аномального роста кости, такого как патологический рост кости после операции замещения тазобедренного сустава, травмы, ожогов или повреждения спинного мозга. Кроме того, ноггин2 может быть применим для лечения или профилактики нежелательных воздействий BMP, ассоциированных с аномальным ростом кости, наблюдаемым в связи с метастазирующим раком простаты или остеосаркомой. Так как известно, что содержание лиганды ВМР2 и ВМР4 значительно увеличивается при астме (Rosendahl et al., Am J Respir Cell Mol Biol. 2002 Aug; 27(2):160-9) и при некоторых других воспалительных заболеваниях, в частности при ревматоидном артрите (Lories et al., Arthritis Rheum. 2003 Oct; 48 (10):2807-18.), то ноггин2 можно также применять для связывания BMP и, таким образом, для лечения воспалительных синдромов.

Так как ноггин2 может связывать activin, он также находит применение для профилактики и лечения связанных с activin заболеваний, например для ингибирования прогрессирования хронической почечной недостаточности, острой почечной недостаточности, панкреатита и бронхолегочной дисплазии новорожденных и т.д. Также его можно применять при повреждениях глаза, таких как травма роговицы при ожогах или попадании чужеродного тела или воспалительных заболеваний глаза, таких как увеит.

Кроме того, нуклеиновые кислоты, белки, и фрагменты ноггин2 по изобретению можно применять для изменения активности специфичных для ноггин2 мишеней у животных, в частности у людей.

Представляющие интерес композиции могут включать белок ноггин2, например рекомбинантный очищенный белок, или химерный белок, содержащий ноггин2, или функциональный фрагмент ноггин2. Указанные композиции могут также включать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ноггин2, способную экспрессировать белок ноггин2 в представляющих интерес клетках, тканях, органах или организмах. Указанные композиции также могут содержать пригодный фармацевтический носитель для системного или локального введения in vivo любым пригодным способом, включающим в себя в качестве неограничивающих примеров инъекцию (например, внутривенную, интраперитонеальную, внутримышечную, подкожную, эндоневральную, периневральную, интраспинальную, внутрижелудочковую, интравитреально, интратекально и т.д.), всасыванием через эпителиальные или слизисто-кожные выстилки (например, через слизистую ротовой полости, ректальную или кишечную слизистую и т.д.) или имплантантов с замедленным высвобождением, включающих в себя клеточные или тканевые имплантанты. В зависимости от способов введения композиция может содержать жидкий носитель, такой как физиологический раствор, являться заключенной в липосомы, микрокапсулы, полимерные или основанные на парафине препараты с контролируемым высвобождением, или являться сформулированным в формы таблетки, пилюли или капсулы. Концентрация применяемого активного ингредиента(ов) зависит от типа заболевания или признаков, которые подвергаются воздействию, от применяемого способа введения, а также от особенностей биологической системы. Эффективные дозы можно получить экстраполяцией кривых "доза-ответ", полученных в тестовых системах in vitro или на животных моделях.

Используемый здесь термин "эффективная доза" обозначает количество белка, необходимое для достижения биологического эффекта, т.е. подавления функции указанных выше представителей суперсемейства TGF-бета. Биологический эффект может выражаться в уменьшении признаков, симптомов или устранении причин заболевания или любых иных изменениях биологической системы. Обычно эффективная доза находится в пределах от 0.1-100 мг/кг субъекта.

Введение может приводить к распределению ноггин2 в организме или в локализованной области. Например, при многих состояниях, вовлекающих дистальные области нервной системы, можно применять внутривенное или интратекальное введение ноггин2. Альтернативно, и не в качестве ограничения, когда вовлечены локализованные области нервной системы, можно применять локальное введение. В таких ситуациях в конкретную область или рядом с ней можно поместить содержащий ноггин2 имплантант. Пригодные имплантанты включают в себя в качестве неограничивающих примеров желатиновую губку, воск или имплантанты, основанные на микрочастицах.

Следующие ниже примеры предложены для иллюстрации, а не с целью ограничения.

Пример 1

Клонирование кДНК ноггин2

кДНК ноггин2 клонировали во время поиска генов Xenopus laevis, вовлеченных в регуляторную сеть гомеобокс-содержащего гена Xanf-1 (Zaraisky et al. Developmental Biology 1992, v.152, pp.373-382; Ermakova et al., Development 1999, v. 126, pp.4513-4523). Для выявления генетических мишеней Xanf-1 авторы провели вычитающую гибридизацию образцов кДНК, полученных из эксплантатов передней эктодермы двух групп эмбрионов Xenopus: в одной группе трансляцию Xanf-1 и его псевдоаллеля у Xenopus laevis, Xanf-2 снизили с применением микроинъекций 1 мМ морфолиновых олигонуклеотидов против Xanf-1 (5'-ATCCTTTCTGAAGAGCAGGAGACAT и 5'-ATCCTTTCTGGAGACCAGTAGACAT, Gene Tools); в другой группе в эмбрионы посредством микроинъекции вводили контрольные морфолиновые олигонуклеотиды (МО), предоставленные Gene Tools Co. В эмбрионы Xenopus laevis на стадии двух бластомеров в анимальные полюса обоих бластомеров проводили микроинъекции МО против Xanf или контрольных МО, смешанных с витальным красителем флюоресцеинлизиндекстраном (FLD). Для каждого из двух типов эмбрионов на стадии средней нейрулы, как описано в Zaraisky et al. Developmental Biology 1992, v.152, pp.373-382, вырезали приблизительно 30 эксплантатов передней нейроэктодермы, взятых вместе с подлежащей энтомезодермой. Для операции выбирали только те эмбрионы, которые обладали равномерным сигналом FLD в передней области. Вычитающую гибридизацию и дифференциальный скрининг проводили с использованием набора реактивов PCR Select kit (BD Clontech). Вставки кДНК всех дифференцированно распределенных клонов (всего приблизительно 50) секвенировали и анализировали в режиме онлайн с применением программ BLAST по базам данных GeneBank и JGI. В результате идентифицировали клон, содержащий полную кодирующую область белка ноггин2. кДНК, содержащую полную кодирующую область ноггин2, реамплифицировали в ПЦР с использованием праймеров 5'-ATTACCGGTGGGAGAACCTTGTTCTTCATT-3' и 5'-ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3' и субклонировали в вектор р35Т. Нуклеотидная и аминокислотные последовательности ноггин2 показаны в SEQ ID NO: 1 и 2.

Пример 2

Воздействие ноггин2 на направление развития клеток

Вектор р35Т, содержащий полную кодирующую часть кДНК ноггин2 (вектор р35Т-ноггин2), был получен, как описано в примере 1.

Полную кодирующую последовательность ноггин1 получали путем ПЦР-амплификации с образца кДНК Xenopus laevis с использованием ноггин1 - специфичных праймеров 5'-TATCCATGGCAAGAAATCGGGAGCA-3' и 5'-ATTCTCGAGTCTCAGCATGAGCATTTGCA-3' и клонировали в вектор р35Т (вектор р35Т - ноггин1).

Синтетические мРНК ноггин2 и ноггин1 получали с применением набора реактивов mMESSAGE MASHINE Kit (Ambion) из векторов р35Т - ноггин2 и вектора р35Т - ноггин1 соответственно, линеаризованных рестрикционной эндонуклеазой EcoRI (Fermentas). Воздействия микроинъекций мРНК ноггин2 на развитие Xenopus laevis сравнивали с ранее описанными воздействиями инъекций мРНК ноггин1 (Smith and Harland, Cell 1992, v.70, pp.829-840; Lamb et al., Science 1993, v.262, pp.713-718; Smith et al. Nature 1993, v.361, pp.547-549). В ходе данных экспериментов мРНК ноггин1 и ноггин2 инъецировали в указанные ниже бластомеры с применением микроинъектора Eppendorf.

Вентральные инъекции 40 пг мРНК ноггин1 в ранние эмбрионы индуцировали вторичную ось тела (фиг. 1А, черная стрелка - первичная ось; серая стрелка - вторичная ось, эффект наблюдали в 68 из 85 подвергнутых микроинъекции эмбрионах), тогда как подобные инъекции мРНК ноггин2 (40 пкг) приводили к развитию грибовидных эмбрионов (фиг. 1Б, эффект наблюдали в 68 из 75 эмбрионах). Таким образом, в отличие от ноггин1 (Dale and Slack, Development 1987, v.100, pp.279-295; Cell 1992, v.70, pp.829-840; Smith et al., Nature 1993, v.361, pp.547-549), ноггин2, несмотря на его предполагаемую способность связывать BMP, не индуцировал вторичной оси тела при инъекции его мРНК в оба вентральных бластомера 8-клеточных эмбрионов. Вместо этого возникали аномальные грибовидные эмбрионы.

Гибридизация in situ на тотальном препарате эмбрионов с инъекцией мРНК ноггин2 с зондами к мРНК нейральных (NCAM, Xanf-1), эпидермальных (ген кератина), мышечных (ген α-актина) генетических маркеров и генетических маркеров поздней мезодермы (brachyury) выявили гигантскую нейрализацию эктодермы и уменьшение мышечной и эпидермальной дифференцировки (фиг. 1В-Ж). Все вместе данные результаты указывают на то, что ноггин2 может нейрализовать эмбриональную эктодерму, но ингибирует дифференцировку дорзальной мезодермы и, таким образом, может препятствовать дорзализующему действию эндогенного ноггин1.

Авторы также применяли эксплантаты, полученные из вентральной краевой зоны (VMZ) эмбрионов на стадии ранней гаструлы, для анализа эффектов ноггин2 на дифференцировку мезодермы. Микроинъекция мРНК ноггин1 вызывает сильное удлинение данных эксплантантов, преобразуя характер их вентральной мезодермы в мышечную мезодерму (дорзализация) (Dale and Slack, Development 1987, v.100, pp.279-295; Cell 1992, v.70, pp.829-840; Smith et al., Nature 1993, v.361, pp.547-549; Фиг. 1З). В отличие от этого, подобно эксплантатам VMZ без инъекции, экспрессирующие ноггин2 или и ноггин1, и ноггин2 эксплантаты остаются округлыми (фиг. 1И).

Для независимого тестирования воздействий ноггин2 на дифференцировку эктодермальных клеток авторы использовали обратную транскрипцию-ПЦР (ОТ-ПЦР) и сравнили экспрессию различных генетических маркеров в эксплантатах "наивной" эктодермы (анимальные шапочки - АС), извлеченных из эмбрионов на стадии ранней гаструлы, в которые посредством микроинъекции ввели мРНК ноггин1 или ноггин2 (фиг. 1К, Л). Авторы также использовали эксплантаты, извлеченные из вентральной краевой зоны (VMZ) эмбрионов на стадии ранней гаструлы, для анализа воздействий ноггин2 на дифференцировку мезодермы (фиг. 1К, Л).

Эксплантаты АС извлекали из эмбрионов, подвергнутых инъекции, с применением микроножа и стеклянной палочки, как ранее описано в Zaraisky et al. Developmental Biology 1992, v.152, pp.373-382. Все эксплантаты инкубировали в течение ночи в растворе 0,5×MMR. Из десяти эксплантатов каждого типа выделяли общую РНК и проводили ОТ-ПЦР, как описано в Zaraisky et al. Developmental Biology 1992, v.152, pp.373-382. Использовали следующие праймеры: ген α-актина: 5'-GCTGACAGAATGCAGAAG и 5'-TTGCTTGGAGGAGTGTGT; brachyury: 5'-GCTGGAAGTATGTGAATGGAG и 5'-TTAAGTGCTGTAATCTCTTCA; церберус: 5'-GCTTTGGTAAATGCATCTCTCTCC и 5'-GGTGACCAGTAAATCATACCTGCT; ген кератина ХК81: 5'-CTGAATAACATGAGAGCTG и 5'-TGGTTCTAGTTGTGGATGT; NCAM: 5'-CCTGCTTATGTGTATCGC и 5'-TTCACAGTACTGGGCTGTGCTT; Xanf-1: описаны в Groppe et al., 2002.

ОТ-ПЦР на основе тотальной РНК из эксплантатов АС и VMZ эмбрионов, подвергнутых инъекции мРНК ноггин1 или ноггин2, осуществляли с праймерами к маркерам нейроэктодермы (NCAM, Xanf-1), эпидермиса (кератин), мышц (α-актин), поздней мезодермы (brachyury) и энтомезодермы (церберус) и Ef-1-α в качестве контроля (фиг. 1Л). Было показано, что ноггин1 и ноггин2 активируют экспрессию нейральных маркеров (NCAM, Xanf-1) и ингибируют эпидермальный маркер (кератин), тогда как только ноггин1 активирует экспрессию мышечного маркера (α-актин) в эксплантатах VMZ. Таким образом, в данном анализе ноггин2 показал сильную нейрализующую активность, подобную активности ноггин1 (Smith and Harland, Cell 1992, v.70, pp.829-840; Lamb et al., Science 1993, v.262, pp.713-718), индуцируя экспрессию маркеров передней части нервной системы, но ингибируя эпидермальный маркер. Способность ноггин2 нейрализовать эктодерму вкупе с его способностью подавлять дорзализующую активность ноггин1 выглядит очень необычно и означает то, что ноггин2, кроме BMP, может связывать некоторые другие факторы, необходимые для дифференцировки мышц.

Пример 3

Подавление дифференцировки эмбриональной мезодермы с использованием ноггин2

Влияние микроинъекций мРНК ноггин2 на дифференцировку эмбриональной мезодермы оценивали, анализируя экспрессию универсального маркера ранних стадий развития мезодермы - гена brachyury - на стадии ранней гаструлы Xenopus laevis. В ходе данных экспериментов мРНК ноггин1 либо ноггин2, полученные как описано в примере 2, инъецировали в экваториальную область одного из вентральных бластомеров на стадии 8 бластомеров в количестве 40 пг с применением микроинъектора Eppendorf.

Результаты эксперимента приведены на фиг. 2. Как видно из фиг. 2А и А', микроинъекции ноггин2 мРНК вызывают ингибирование экспрессии гена brachyury в области микроинъекции, что свидетельствует о подавлении в этом месте дифференцировки эмбриональной мезодермы. В то же время аналогичные микроинъекции мРНК ноггин1 не вызывают ингибирование экспрессии brachyury и, соответственно, подавления развития мезодермы (фиг.2Б и Б').

Результаты этих экспериментов ясно свидетельствуют о том, что в отличие от ноггин1 ноггин2 обладает уникальной способностью подавлять дифференцировку эмбриональной мезодермы.

Пример 4

Ингибирование сигнального каскада BMP с помощью ноггин2

Способность ноггин2 ингибировать сигнальный каскад BMP оценивали по способности ноггин2 подавлять экспрессию основной генетической мишени этого каскада - гомеобоксного гена Vent2 - в эксплантатах эмбриональной эктодермы зародышей (АС эксплантаты), микроинъецированных смесью мРНК ноггин2 и мРНК ВМР2, ВМР4 либо ВМР7. Учитывая литературные данные о том, что разные BMP способны проявлять повышенную активность, образуя гетеродимеры, в специальной серии опытов мРНК ноггин2 смешивали для микроинъекций с мРНК всех вышеуказанных BMP одновременно. В качестве контроля аналогичные опыты проводили с мРНК и ноггин1.

Экспрессию гена Vent2 анализировали с помощью ОТ-ПЦР основе тотальной РНК из АС эксплантатов, как описано в Примере 2. Использовали следующие Vent2-специфические праймеры: 5'-ACTGAACACAAGGACTAATACA и 5'-AGAGGCCAGAGACTGCCCAA.

Было установлено, что ноггин2 способен подавлять активацию экспрессии Vent2, индуцируемую любым из указанных BMP, а также их смесью. При этом ингибирование Vent2 наблюдалось даже в том случае, если концентрация микроинъецированной мРНК BMP превышала таковую ноггин2 в 30 раз. Напротив, ингибирование BMP каскада ноггин1 наблюдалось только в том случае, если концентрация мРНК BMP не превышала концентрацию мРНК ноггин1. Эти данные показывают, что ноггин2 является гораздо более эффективным ингибитором BMP каскада, чем ноггин1.

Для прямого исследования способности белка ноггин2 связывать молекулы BMP в зародышах X.laevis были экспрессированы активные формы ноггин2 и ВМР4 в составе экспрессионных векторов pCS2-3Myc-noggin2 и pCS2-3Flag-BMP4, соответственно.

Для получения pCS2-3Myc-noggin2 вектора нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности эпитопа белка Мус (EQKLISEEDLEQKLISEEDLEQKLISEEDL), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК ноггин2 непосредственно на 3' конец последовательности, кодирующей сигнальный пептид ноггин2. Для этого на первой стадии клонирования были получены соответственно 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК ноггин2 в ПЦР с праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGAAGAGGATAAATCTGC-3' и 5'-GAGGTCTTCCTCCGATATCAGCTTCTGTTCCAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCATAAGGCTGACAGCACCCCTGA-3', 5'-GAACAGAAGCTGATATCGGAGGAAGACCTC GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGCTCAGGCTTAGACCCTCT-3' и 5'-ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3' соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGAAGAGGATAAATCTGC-3' и 5'-ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3'. Полученная полноразмерная кДНК ноггин2, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности Мус, была клонирована в вектор pCS2 по рестриктным сайгам NcoI(тупой)/AgeI(тупой) и XhoI/XhoI. Для получения pCS2-3Flag-BMP4 вектора нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности Flag (DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК ВМР4 непосредственно на 3' конец последовательности, кодирующей прорегион белка ВМР4 Xenopus laevis. На первой стадии клонирования были получены 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК ВМР4 в ПЦР с праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGATTCCTGGTAACCGAATG-3' и 5'-TTTGTCATCATCGTCTTTGTAGTCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGTTTTGGACT TCTTTTTGAC-3', 5'-GACTACAAAGACGATGATGACAAAGATTACAAGGATGACGACGATA AGCAGAGACCCCGTAAAAAAAAC-3' и 5'-AATCTCGAGTCAACGGCACCCACACCCTTCCA-3' соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGATTCCTGGTAACCGAATG-3' и 5'-AATCTCGAGTCAACGGCACCCACACCCTTCCA-3'. Полученная полноразмерная кДНК ВМР4, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности эпитопа Flag, была клонирована в вектор pCS2 по рестриктным сайтам NcoI(тупой)/AgeI(тупой) и XhoI/XhoI.

600 пг синтетической мРНК 3Myc-noggin2 и 600 pg синтетической мРНК 3Flag-BMP4 были микроинъецированы в развивающиеся зародыши X. laevis на стадии 2-х бластомеров. В дальнейшем эти зародыши были инкубированы в растворе 0.1 MMR до стадии ранней гаструлы.

Выделение экспрессированных белков проводилось путем лизирования зародышей на стадии ранней гаструлы по методике, описанной в Tanegashima et al., Int.J.Dev.Biol (2004) 48:275-283.

После выделения проводилась абсорбция экспрессированного белка 3Flag-BMP4 на смоле Flag-Agarose (Sigma) согласно протоколу производителя. После промывки смолы в соответствии с протоколом производителя наличие на этой смоле связавшегося белка 3Myc-noggin2 анализировалось методом белкового блоттинга с помощью Мус-специфических моноклональных антител (Sigma).

Данный эксперимент выявил способность молекул белка ноггин2 связывать молекулы белка ВМР4 (фиг. 2Ж).

Для исследования способности белка ноггин2 ингибировать в клетках эмбрионов сигнальный путь BMP, индуцированный BMP, было проанализировано влияние ноггин2 на фосфорилирование внутриклеточного передатчика этого сигнального пути - белка Smadl. Для этого эмбрионы шпорцевой лягушки инъецировали на стадии 2-4 клеток либо мРНК ВМР4 (100 pg/эмбрион), либо смесью мРНК ВМР4 (10 пг/эмбрион) и ноггин2 (1 пг/эмбрион). Анализ фосфорилирования Smadl в инъецированных эмбрионах проводили на стадии начала гаструляции (стадия 10) методом вестерн-блоттинга при помощи коммерческих моноклональных антител к Phospho-Smadl (Cell Signalling Technology). В результате было показано, что ноггин2 способен блокировать повышение концентрации Phospho-Smadl, вызванное ВМР4 (фиг. 2, З).

Пример 5

Ингибирование сигнального каскада activin/nodal с помощью ноггин2

Способность ноггин2 ингибировать сигнальный каскад activin/nodal оценивали по способности ноггин2 подавлять экспрессию основной генетической мишени этого каскада - гена brachyury - в эксплантатах эмбриональной эктодермы зародышей (АС эксплантаты), микроинъецированных смесью мРНК ноггин2 и мРНК Xnr1, Xnr2, либо Xnr4 (гомологи гена nodal млекопитающих). В качестве контроля, аналогичные опыты проводили с мРНК и ноггин1.

Экспрессию гена brachyury анализировали с помощью ОТ-ПЦР по общей РНК из АС эксплантатов, как описано в Примере 2.

Было установлено, что ноггин2 способен подавлять активацию экспрессии brachyury, индуцируемую любым из указанных Xnr. При этом ингибирование brachyury наблюдалось только в том случае, если концентрация микроинъецированной мРНК Xnr не превышала таковую ноггин2. В отличие от этого ноггин1 не способен ингибировать активацию гена brachyury в аналогичных тестах. Эти данные демонстрируют, что в отличие от ноггин1 ноггин2 способен ингибировать не только сигнальный каскад BMP, но и каскад, активируемый членами другого большого надсемейства TGF-β факторов - activin/nodal.

Для исследования способности белка ноггин2 связывать молекулы белка activin в зародышах X.laevis были экспрессированы активные формы ноггин2 и activin-B в составе экспрессионных векторов pCS2-3Myc-noggin2 и pCS2-3Flag-activin-B, соответственно.

Получение pCS2-3Myc-noggin2 вектора было осуществлено как описано в Примере 4.

Для получения pSP64T-3Flag-activin-B вектора нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности Flag (DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК activin-B непосредственно позади последовательности, кодирующей прорегион белка activin-B Xenopus laevis. На первой стадии клонирования были получены 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК activin-B в ПЦР с праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGGCTCTCCTGTTACTGCCTCTG-3' и 5'-TTTGTCATCATCGTCTTTGTAGTCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCGAGGCCTCTCTTACGGA-3', 5'-GACTACAAAGACGATGATGACAAAGATTACAAGGATGACGACGATAAG TGCGATGGACACACAAATT-3' и 5'-AATGAATTCATGCACAGCCGCACTCGTCCA-3' соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'-AATTGGATCCGCCACCATGGCTCTCCTGTTACTGCCTCTG-3' и 5'-AATGAATTCATGCACAGCCGCACTCGTCCA-3'. Полученная полноразмерная кДНК activin-B, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности эпитопа Flag, была клонирована в вектор pSP64T по рестриктным сайтам HindIII(тупой)/Agel(тупой) и EcoRI/EcoRI.

Анализ способности экспрессированного белка 3Myc-noggin2 связывать молекулы белка 3Flag-activin-B был проведен с помощью специфических антител по методике, описанной в Примере 4.

Данный эксперимент выявил способность молекул белка ноггин2 связывать молекулы белка activin-B (фиг. 2 Ж).

Для исследования способности белка ноггин2 ингибировать в клетках эмбрионов сигнальный путь activin/nodal, индуцированный activin, было проанализировано влияние ноггин2 на фосфорилирование внутриклеточного передатчика этого сигнального пути - белка Smad2. Для этого эмбрионы шпорцевой лягушки инъецировали на стадии 2-4 клеток либо мРНК activinB (100 pg/эмбрион), либо смесью мРНК activinB (10 pg/эмбрион) и Noggin2 (1 ng/эмбрион). Анализ фосфорилирования Smad2 в инъецированных эмбрионах проводили на стадии начала гаструляции (стадия 10) методом вестерн-блоттинга при помощи коммерческих моноклональных антител к Phospho-Smad2 (Cell Signalling Technology). В результате было показано, что ноггин2 способен блокировать повышение концентрации Phospho-Smad2, вызванное activinB (фиг. 2, З).

Пример 6

Одновременное ингибирование сигнальных каскадов BMP и activin/nodal и индукция головных структур с использованием ноггин2

Как известно, дифференцировка структур главной оси тела позвоночных ингибируется на брюшной стороне эмбриона в результате перманентной активации двух основных TGF-β-каскадов: BMP и activin/nodal. При этом селективное ингибирование BMP каскада приводит "по умолчанию" к развитию структур, характерных для туловищной и заднеголовной части оси тела, в частности к развитию спинного мозга и мышц. В то же время одновременное ингибирование как BMP, так и activin/nodal каскадов вызывает индукцию переднеголовных структур, в том числе глаз и переднего мозга.

В нормальном развитии подавление BMP каскада на спинной стороне эмбриона осуществляется специфическими белковыми факторами, секретируемыми клетками шпемановского организатора и способными связывать BMP. Наиболее известным из них является ноггин1. Микроинъекции мРНК ноггин1 в вентральные вегетативные бластомеры эмбриона Xenopus способны вызывать развитие дополнительных туловищных структур на брюшной стороне тела эмбриона. При этом вторые оси тела, индуцируемые экзогенным ноггин1, никогда не содержат переднеголовных структур, для развития которых необходимо одновременное ингибирование как BMP, так и activin/nodal каскадов. В нормальном развитии ингибирование activin/nodal каскада, а также тесно связанного с ним положительной обратной связью Wnt-сигнального каскада осуществляется другими факторами, секретируемыми клетками головной части шпемановского организатора. Наиболее известными из них являются Dikkopf и церберус. Причем последний белок способен связывать сразу три фактора: BMP, nodal и Wnt. В результате в ростральной части эмбриона снимается запрет на активацию программы переднеголовной дифференцировки и происходит развитие переднеголовных структур.

Способность ноггин2 ингибировать одновременно как каскад BMP, так и каскад activin/nodal, указывает на потенциальную способность этого фактора индуцировать переднеголовные структуры. Однако в опытах, описанных в Примере 2, подобный эффект мог быть маскирован сильным нейрализующим действием ноггин2, вызванным относительно высокими концентрациями микроинъецируемой мРНК.

В связи с этим была изучена способность низких концентраций ноггин2 индуцировать развитие дополнительных переднеголовных структур в целых эмбрионах. В данной серии опытов синтетическую мРНК ноггин2, полученную также, как описано в Примере 2, микроинъецировали в один из вентральных вегетативных бластомеров эмбрионов Xenopus laevis на стадии 8-16 бластомеров в количестве 2-5 пг. В результате, у 25% эмбрионов наблюдалось развитие дополнительного переднеголовного отдела. Как было показано с помощью метода гибридизации in situ со специфическими зондами к мРНК переднеголовных маркеров BF-1 и Рах-6, такие дополнительные головные структуры включали конечный мозг и глаза (Фиг.2, В и В'; Д и Д'). Аналогичные структуры отсутствовали в составе дополнительных осей тела, индуцированных микроинъекциями мРНК ноггин1 (фиг. 2, Г и Г'; Е и Е'). Эти данные демонстрируют качественное отличие эффектов ноггин2 от эффектов ноггин1, связанное со способностью ноггин2 ингибировать как BMP, так и activin/nodal сигнальный каскад.

Пример 7

Получение рекомбинантного белка ноггин2

Для получения активного гомодимера ноггин2 осуществляли экспрессию ноггин2 в культуре эпителиальных клеток зеленой мартышки CV-1 в составе экспрессирующего вектора pcDNA3-6His-noggin2. Для получения pcDNA3-6His-noggin2 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина, была встроена с помощью ПЦР в кДНК ноггин2 непосредственно позади последовательности, кодирующей сигнальный пептид ноггин2. На первой стадии клонирования были получены соответственно 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК ноггин2 в ПЦР с праймерами 5'-ATTACCGGTGGGAGAACCTTGTTCTTCATT-3' и 5'-GTGATGGTGATGGTGATGCCCGGGATAAGGCTGACAGCACCCCT-3', и 5'-CATCACCATCACCATCACGGGCCCTATCTCAGGCTTAGACCCTC-3'' и 5'-ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3'. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с праймерами 5'-ATTACCGGTGGGAGAACCTTGTTCTTCATT-3' и 5'-ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3'. Полученная полноразмерная кДНК ноггин2, содержащая последовательность, кодирующую 6 гистидинов, была клонирована в вектор pcDNA3 по рестриктным сайгам NcoI (тупой) и XhoI.

Эпителиальные клетки зеленой мартышки (CV-1) культивировали в DMEM среде (Sigma) с 10% сывороткой (Biolot), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина при 37°С и 1 атм. Для получения постоянной клеточной линии, продуцирующей 6His-noggin2, эти клетки были трансфицированы pcDNA3-6His-noggin2 вектором. Последующую селекцию проводили в среде, содержащей 1 мкг/мл генетицина (Gibco BRL). Секретируемый рекомбинантный 6His-Noggin2 получали из культуральной среды при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Qiagen). Выход белка был оценен как 50 мкг/миллион клеток в день. Активность белка подтверждали по его способности активировать нейрогенез в эксплантатах эмбриональной эктодермы.

Пример 8

Получение поликлональных антител против ноггин2 кДНК, содержащую полную кодирующую область ноггин2, реамплифицировали как описано в примере 1, субклонировали в вектор pQE30 и использовали для трансформации Escherichia coli. Рекомбинантный белок, содержащий шесть гистидиновых остатков, очищали с использованием аффинной хроматографии на Talon Resin (Clontech Laboratories, Inc.) в денатурирующих условиях и использовали для иммунизации кроликов по стандартной технологии. Поликлональную сыворотку тестировали против рекомбинантного белка с помощью методов ELISA и Вестерн-блота.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к белкам семейства ноггин2 и может быть использовано в медицине. Сигнальный каскад activin блокируют путем введения ноггин2 в организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности activin. Изобретение позволяет эффективно блокировать активность белка activin. 2 ил.

Способ блокирования сигнального каскада activin путем связывания ноггин2 с белком activin, предусматривающий введение ноггин2 в организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности activin.