ШТАММ Penicillium sizovae - ДЕСТРУКТОР ЛИГНИНА ДРЕВЕСИНЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 C12R1/80 

Изобретение относится к экобиотехнологии и касается разложения микромицетами древесных и растительных отходов, в том числе деструкции лигнина в составе древесины.

Лигнин является наиболее трудноразлагаемым биополимером древесины как с помощью физико-химических, так и микробиологических методов. Выделение лигнолитических штаммов микро- и макромицетов позволяет разработать на их основе технологии утилизации древесных отходов, которые не подлежат вторичному использованию (ветви, сучья, кора и т.п.). Известны различные таксономические группы организмов, способных к деструкции древесного и растительного сырья.

В качестве аналога был принят штамм Penicillium verruculosum (Соловьева И.В., Окунев О.Н., Вельков В.В., Кошелев А.В, Бубнова Т.В., Кондратьева Е.Г., Скомаровский А.А., Синицын А.П. Получение и свойства мутантов - суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз. // Микробиология, - 2005. - Т.74. - №2. - с.172-178) - продуцент целлюлаз, который способен синтезировать ферментный целлюлозолитический комплекс и расщеплять целлюзосодержащие отходы.

Данный штамм продуцирует карбогидразы, однако его способность гидролизовать лигнин цельной древесины при твердофазном культивировании не охарактеризована.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Paecilomyces variotii (Коломиец Э.И., Романовская Т.В., Здор Н.А., Элланская И.А., Вадецкий Б.Ю., Зайцев Г.М., Стахеев И.В., Босякова И.А. Штамм микромицета Paecilomyces variotii, используемый для очистки вод от фенолов или лигнина. - Авторское свидетельство SU №1671683 А1, C12N 1/14 // 1989, Бюлл. №31), используемый для очистки сточных вод от лигнина. Данный штамм в условиях жидкофазного культивирования в ферментере способен к разложению диоксанлигнина и гидролизного лигнина, концентрация которых за 3 сут снижается на 30-35%.

Однако для микробиологического разложения лигнина древесно-растительных отходов необходимо обеспечить возможность твердофазного культивирования на утилизируемых отходах.

Цель изобретения - получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью к разложению лигнина цельной древесины в условиях твердофазного культивирования.

Штамм Penicillium sizovae был выделен из гнилой древесины ели.

Способ выделения штамма

Для выделения штамма берут образцы гнилой древесины и помещают их на агаризованную среду следующего состава: NaNO₃ - 3,0 г/л, К₂HPO₄ - 1,0 г/л, MgSO₄·7H₂O - 0,5 г/л, KCl - 0,5 г/л, FeSO₄·7H₂O - 0,01 г/л, агар-агар бактериологический - 20 г/л. В качестве источника углерода используют стерильную фильтровальную бумагу, положенную на поверхность разлитой в чашки Петри среды. Выращивание проводят в течение двух недель при температуре 30°С. Чистые культуры микроорганизмов выделяют из отдельных колоний, полученных путем рассева образовавшихся накопительных культур на чашки Петри с агаром Чапека.

Чистые культуры микроорганизмов исследуют на способность к деградации лигнина и целлюлозы - основных биополимеров древесины. Способность к деградации целлюлозы оценивают путем выращивания культур на агаризованной минеральной среде с добавлением 0,1% карбоксиметилцеллюлозы. После трехсуточного культивирования при температуре 30°С поверхность чашки заливают 0,1% раствором конго красного на 15 мин, затем краситель сливают и наливают 1 М раствор хлорида натрия на 10 мин. Наиболее активный штамм отбирают по наибольшему значению соотношения диаметра зоны просветления к диаметру колонии.

Способность к деградации лигнина оценивают путем выращивания культур на агаризованной минеральной среде с добавлением 0,5% танина. После трехсуточного культивирования при температуре 30°С отмечают наличие бурого окрашивания в зоне роста колонии (реакция Бавендамма), определяют соотношение диаметра зоны бурого окрашивания к диаметру колонии.

Окончательно штамм получают путем отбора наиболее активной колонии по результатам вышеупомянутых операций.

Способ получения культур

Культуры штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11 получают путем выращивания на скошенной в пробирках плотной питательной среде Чапека в течение трех суток при температуре 30°С, хранят при температуре 4-6°С в течение двух месяцев, затем пересевают на новую питательную среду. Лиофильно высушенные культуры получают путем высушивания в вакууме в течение 6 ч, хранят при температуре минус 20°С в течение трех лет.

Культурально-морфологические признаки

Макроскопические признаки

Образует на среде Чапека колонии зеленого цвета с желтовато-сероватым оттенком, по краю - с голубоватым оттенком. Растущий белый край плоский, с резкой границей, ширина - 0,5 мм. Поверхность колонии бархатистая, слегка выпуклая, край плоский, центр колонии рыхлый, при прикосновении препаровальной иглой разрушается. С обратной стороны колония светло-желтого цвета. Агар не пигментирован. Отмечено выделение на поверхность колонии прозрачного экссудата. Диаметр колонии после 5 суток роста на среде Чапека при температуре 30°С 12-15 мм. Гифы субстратного мицелия белые, в зоне растущего края - прозрачные. Внешний вид колонии представлен на фото 1.

Микроскопические признаки

Имеет гифальное строение, гифы септированные. Размножение конидиальное, конидиальная структура имеет вид кисточки. Конидиеносцы гладкие. Кисточка двухъярусная, разветвленная. Имеется по 2-4 метули, гладкие, с расширенным основанием. Стеригмы по 4-6 в пучке, гладкие, бутылковидные. Конидии шаровидные, мелкошероховатые. Структура кисточки приведена на фото 2.

Идентификация штамма

Идентификацию проводили на основании изучения культурально-морфологических признаков и микроскопического строения с использованием соответствующих определителей (Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель грибов. / Пер. с англ. - М.: Мир, 2001. - 468 с.; Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель микромицетов. - Киев: Наукова думка, 1990. - 236 с.; Пидопличенко Н.М. Пенициллин (Ключи для определения видов). - Киев: Наукова думка, 1972. - 152 с.).

Сведения о депонировании

Указанный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Вятского государственного университета (г.Киров), штамму присвоен регистрационный номер VGUCM-P11.

Физиолого-биохимические свойства

Усваивает глюкозу, лактозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, арабинозу, целлобиозу, мальтозу, ксилозу, трегалозу, раффинозу.

Использует аргинин, лизин, орнитин, маннитол.

Отношение к температуре. Хорошо растет при температуре от 20 до 35°С, оптимум роста при 28-30°С.

Отношение к кислороду. Аэроб.

Отношение к значению рН. Растет в широком диапазоне рН - от 4,0 до 8,0, оптимум 6,8-7,4.

Биотехнологическая характеристика

Штамм Penicillium sizovae выращивают в жидкой среде Чапека-Докса (рН 7,2±0,2) в колбах объемом 250 мл в шейкере-инкубаторе при температуре 30°С и скорости перемешивания 200 об/мин в течение двух суток. В качестве инокулята используют культуру, хранящуюся на скошенном в пробирке агаре, внося в жидкую среду 2-3 петли. Выход биомассы составляет 11,2 г/л.

Пригодность штамма для использования в качестве деструктора лигнина древесины доказывается следующими примерами.

Пример 1

Полученную вышеуказанным способом посевную культуру штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11 используют для засева высушенных измельченных (размеры - не более 0,5 мм) стерильных еловых опилок из расчета 1,5 мл посевной культуры на 100 мг опилок. Первые сутки засеянные опилки подвергают шуттелированию при температуре 30°С и далее выращивают в статических условиях при температуре 30°С. Отрицательным контролем служат опилки, засеянные культурой дрожжей Saccharomyces vini (микроорганизм, заведомо неспособный к деструкции лигнина) и выдержанные в тех же условиях, что и опытные.

Через 8 суток твердофазного культивирования определяют содержание лигнина в опилках весовым методом.

Результаты определения степени деструкции лигнина опилок представлены в табл.1.

Приведенные данные показывают, что заявленный штамм Penicillium sizovae обладает лигнинразрушающей способностью, убыль лигнина еловых опилок на 8 сутки поверхностного культивирования при температуре 30°С составила 7,4%.

Таблица 1
Убыль лигнина еловых опилок на 8 сутки поверхностного культивирования штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11 № опыта Содержание лигнина…, мг/100 мг опилок Убыль лигнина, % Среднее значение убыли лигнина, % в исследуемой пробе в контроле 1 30,9 33,5 7,8 7,4 2 31,4 33,8 7,1 3 30,7 33,1 7,4

Таким образом, штамм Penicillium sizovae обладает деструктивной способностью в отношении лигнина древесных опилок и может быть использован в технологии утилизации древесных отходов.

Пример 2

Выращивание посевной культуры и засев опилок проводят, как описано в примере 1. Степень биодеградации лигнина в образцах опилок определяют через 4, 7, 10 и 13 суток с начала культивирования. Результаты приведены в табл.2.

Таблица 2
Динамика убыли лигнина еловых опилок в процессе поверхностного культивирования штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11 Продолжительность культивирования, сут Содержание лигнина…, мг/100 мг опилок Убыль лигнина в исследуемой пробе, % в исследуемой пробе в контроле 4 32,5 33,7 3,6 7 31,0 33,1 6,3 10 31,3 34,0 7,9 13 30,1 32,8 8,2

Из представленных данных следует, что максимальный прирост убыли лигнина отмечается на 7 сут, к 10 сут скорость деструкции убывает.

Таким образом, наибольшая степень деструкции лигнина древесины при использовании биопрепарата на основе штамма Penicillium sizovae может быть достигнута на 7-10 сутки твердофазного культивирования.

Пример 3

Выращивание посевной культуры и засев опилок проводят, как описано в примере 1. В питательную среду, предназначенную для выращивания посевной культуры, для выявления индукции лигнолитической активности добавляют измельченные опилки или лигнин в концентрации 2,5 и 0,4 г/л соответственно. Указанные концентрации были выбраны опытным путем. В качестве препарата лигнина использовали отмытый гидролизный лигнин. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3
Убыль лигнина еловых опилок на 8 сутки поверхностного культивирования штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11 при выращивании посевной культуры на средах Чапека-Докса с добавлением опилок или лигнина Питательная среда, использованная для получения посевной культуры Содержание лигнина…, мг/100 мг опилок Убыль лигнина в исследуемой пробе, % в исследуемой пробе в контроле Чапека-Докса с добавлением опилок 31,8 33,6 5,4 Чапека-Докса с добавлением лигнина 30,1 33,2 9,3 Чапека-Докса без добавок (по данным табл.1) 31,0 33,5 7,4

Как следует из данных, приведенных в табл.3, убыль лигнина еловых опилок при выращивании посевной культуры на среде с добавлением опилок оказалась ниже, чем без их добавления. Стимулирующее действие лигнина, добавленного в питательную среду при выращивании посевной культуры, проявилось как в усилении интенсивности роста, так и в увеличении убыли лигнина в опилках на 1,9%.

Полученные данные могут быть использованы для усиления деструктивной способности биопрепарата на основе штамма Penicillium sizovae VGUCM-P11.

Штамм микромицета Penicillium sizovae P11 выделен из гнилой древесины ели. Штамм хранится в коллекции микроорганизмов Вятского государственного университета под регистрационным номером VGUCM-P11. Штамм обладает высокой лигнолитической активностью. Деструкция лигнина составляет 7,4% по массе. 2 ил., 3 табл.

Штамм микромицета Penicillium sizovae P11 (хранящийся в коллекции микроорганизмов Вятского государственного университета под регистрационным номером VGUCM-P11) - деструктор лигнина древесины.