Штамм микромицета РаесILомYсеS VаRIотII, используемый для очистки сточных вод от фенолов или лигнина Советский патент 1991 года по МПК C12N1/14 

Изобретенне относится к биотехнологии и касается нового штамма микро- мицета Paecilomyces variotii, который может быть использован для очистки сточных вод от фенольных соединений, лигнина и его производных на предприятиях целлюггозно-бумажнои, нефтяной, углехпмической промышленности и других ее областей.

Целью изобретения является сокращение прологгжитетьности очистки и повышение ее зффектипности.

Изобретеиче исключается в том, что использую пп 1мм мнкромицетл P.variotii BKMF-3091U, который осуществляет быструю и эфЛективную биологическую очистку от фенолов или лигнеподобных соединений.

Штамм гриба P.variotii KP3 (BKJfF- 3091D) выделен из гидролизного лигнина (ГЛ), взятого из отвалов Бобруйского гидролизно-дрожхевого завода.

Штамм получают следующим образом.

2 г ГЛ после продолжительного хранения вносят в колбу объемом 250 мл с мл среды Чапека, содержащей в качестве источника углерода смесь (100 мг/л) гаенольнмх соединений, наиболее часто присутствующих в промытО

3

00 00

ленных стоках целлюлозно-бумажных заводов - гваякол, пирокатехин, фенол, ванилин, бензойная и м-метоксибензой- ная кислоты, и выдерживают при 28 - 30 С в стационарных условиях. После 20 сут инкубации 5 мл накопительной культуры вносят в колбу со свежей средой того же состава и выращивают на качалке при том же температурном режиме. Контролируют степень утилизации фенолов. После полного усвоения источников углерода из колбы делают высев в пять колб со свежей средой, содержащей 2-кратную концентрацию фенолов (290 мг/л). С целью получения наиболее активного штамма, утилизирующего (Ъанольные соединения, проводят обогащение накопительной культуры микроорганизмами-деструкторами этих соединений Для этого из колбы, в которой процесс утилизации субстрата идет наиболее быстро, делают высев в пять колб, содержащих минеральную среду с Ленолами. Из этих колб опять отбирают одну, в которой процесс утилизации источников углерода происходит быстрее. Эту операцию повторяют в два раза.

Чистую культуру гриба выделяют из отдельной колонии, полученной путем рассева обогащенной накопительной культуры на чашки с агаризованной минеральной средой с фенолами. Чистую культуру гриба еженедельно пересевают в течение 3 мес на жидкой минеральной среде, содержащей 250 мг/л смеси фенолов - гваякола, пирокатехина, фенола, ванилина, бензойной и м-метоксибензой ной кислот. Окончательно штамм полу- чен путем выделения наиболее быстро растущей колонии на минеральной агари эованной среде с 300 мг/л смеси Фенолов. Наряду с фенолами гатамм способен к деструкщ-ш гидролизного лигнина - субстрата, из которого он выделен.

Штамм сохраняет жизнеспособность в течение 6 мес при хранении на скошенном сусло-агаре и в течение 2 лет в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм гриба P.variotii КРЗ имеет следующие культуральнй-морфологичес- кие и физиолого-биохимические характеристики .

ИорФолого-культуральные свойства.

Сусло-агар. Колонии округлые, поверхность мучнистая, край колонии ворсинчатый. Желтовато-коричневые со

3

светлой каймой по краям. На пятые сутки роста диаметр колонии 3 см, с обратной стороны светло-коричневый пигмент. Вегетативные гифы светлые,

5 0 5

0 5 0 5

50

5

3-5,5 мкм шириной. Краевые гифы утолщенные до 20 мкм. Конидиеносцы состоят из густых мет ш, несущих 2- 1 Фиалид, различных чо величине, чаще 12 - 20x2,5 - 5,0 мкм. Конидии светлые до желтых или желто-коричневых, в массе гладкие, различные по величине и Форме, чаше почти шаровидные или эллипсоидные, иногда цилиндрические или булавовидные 3,5 - 15х х2 - 5 мкм.

Картофеле-глюкозкый агар. Колонии округлые, поверхность мучнистая, край колонии ворсинчатый. Орехового цвета, с возрастом темнеют, но никогда не бывают зелеными. Широко разрастаются на субстрате, большей частью со спороносными ползучими гифами. С обратной стороны - светло-коричневые. Кони- диеносные гифы с перегородками, обычно короткие, ползучие. Стеригмы 15 - 20x3 мкм, с длинной заостренной шейкой, часто в пучках, которые нередко расположены на веточках в кисточках, или стеригмы одиночные, отходящие непосредственно от гиф. Конидии желтоватые или коричневые, эллиптические или веретеновидные 5 -7x2,5 -3,0 мкм.

Агар Чапека-Докса с гидролизным лигнином. Колонии округлые, серо-коричневого цвета, состоят из тонкого войлока и множества конидиеносцёв, мучнистые. Обратная сторона колонии темная. На 5-е сутки роста колонии достигают в размере 4 см. Фиалиды одиночные и в мутовках, обычно у основания расширенные, расположены на верхушках, обычно у основания расширенные, расположены на верхушках простых или разветвленных конидиеносцёв, вдоль основной оси конидиеносцёв или прямо на гифах, конидии в длинных цепочках .

Физиолого-биохимические свойства.

Отношение к углеводам: сахара не сбраживает; ассимилирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, ксилозу, галактозу, арабинозу, рамнозу, лактозу, маннозу. Расщепляет крахмал, целлюлозу.

i

Отношение к спиртам: усваивает глицерин, дульцит, маннит, сорбит, этанол, метанол.

Отношение к кнснотам: усплинас-т уксусную, молочную, лимочну), янтарную, мурлньиную, фумаровую, яблочную, щавелевую кислоты.

Отношение к источникам азота: использует аммонийный азот, нитратный, азот аспарагина, пептона, мочевины.

Культура усваивает широкий спектр ароматических соединений, хорошо растет на лигнине .

Отношение к температуре. Оптимум роста при 25 - 35°С, выдерживает температуру 50° С.

Отношение к кислороду: аэроб.

Растет в широких диапазонах рН - 3,3 - 7,5, с оптимумом 4,5 - 5,5.

Пример 1 . 1(1тамм гриба P.vario til выращивают на разбавленном до 1 - 2 Б пивном сусле в течение 1 - 2 сут В 100 мл среды, содержащей пирокатехин или любое другое фенольное соединение: гваякол, фенол, ванилин, бензойную, м-метоксибензойную кислоты в концентрации 150 мг/л, вносят ино- кулят в количестве 5% от объема среды и через 12 - 20 ч культивирования в колбах на качалке при 30fiC определяют - остаточное содержание фенолов газохро- матографическим методом.Полная утилизация пирокатехина.гваякола,фенола,

ванилина достигается к 12 ч,а бензойной и м-метоксибензойной кислот - к 16 - 20 ч роста культуры (табл. 1).

П р и м е р 2. Оценивают способность P.variotii разлагать различные виды лигнинов, в частности диоксан- лигнин, по составу и строению близкий к нативному, и лигнин Кпасона - наиболее конденсированный и устойчивый к микробному воздействию. Диоксан-лиг нин выделен из еловой древесины. Деструкция лигнина Класона изучена при выращивании культуры на гидролизном лигнине, в котором содержание лигнина Класона достигает 55 - 70%. Из остальных компонентов ГЛ наибольший удельный вес занимает целлюлоза (27 - 30%), экстрактивные (6%) и минеральные (5%) вещества. Культивирование P.variotii проводят в ферментере АК- 10 при 30°С, интенсивности аэрации 1 л/л-мин и скорости перемешивания 300 об/мин на питательных средах состава, г/л:

диоксан-лигнин 10 (по сухой массе)

o - .

- .

5

NH4:jn3 0,5, кнгт4 V1. .so } ),-,,

кукурузный экстракт 4, вода - до 1 ч (среда I); пщропизный лигнин Iм (ко сухой массе), остальные компоненты, как в среде I, при рН сред 5,0 - 5..

В табл. 2 представлена динамик. роста и потребления основных компонентов среды при выращппанни гриба

Ю на диоксан-лигнине и гидролизном лигнине. Активное расщепление лигнинов культурой P.variotii КРЗ начинается с 24 ч роста и за 3 сут (Ьерментлцион- ного процесса концентрация диокган15 лигнина в среде снижается на 35,1, а лигнина Класона - на 30%. Эффективность деструкции дноксан-лигнина практически в 2 раза выше, чем лигнина Класона (табл. 3).

-0П р м м е р 3. Птамм гриба P.variotii КРЗ культивируют на сульфитном щелоке - основном источнике загрязнения сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности токсическими ароматн 25 ческими соединениями.

Сульфитный щелок получен на Светлогорском целлюлозно-бумажном заноде и имеет следующий состав, %: сухое вещество 17,9; зола 1,2; органические

30 кислоты 0,6; сахара 4,0; лигносульфо- нат 10,5. Газохроматографический анализ свидетельствует также о наличии в щелоке 16 свободных фенольных соединений, среди которых наиболыгачй удель35 ный вес занимают пирокатехин

(238,4 мг/л), вератровая кислота (77,2 мг/л), резорцин (53,2 мг/л), м-метоксибензойная кислота (41,2 мг/л), гваякол (32,6 мг/л), ванилин

40 (30,8 мг/л), бензойная кислота , (22,4 мг/л).

При приготовлении питательной среды для P.variotii КРЗ сульфитный щелок разбавляют водой в соотношении

45 1:3 и добавляют минеральные соли, г/л: (Ш4)г504 0,5; KHtP04 1,0; MgSO 0,5, а рН среды доводят до 5,5. Культивирование проводят по примеру 2. Наряду с активным потреблением саха5( ров за 12-16 ч роста культура полнос тью утилизирует абсолютное большинство фенольных соединений, щелока и только м-метоксибензойная кислота и

резорцин потребляются к этому времени ее соответственно на 86,4 и 82,7%. При

этом концентрация жизнеспособных клеток в 1 мл питательной среды увеличиН вается в 4 раза по сравнению с исход- ной и составляет 4-10 . Это свиде7

Формула изо G p P т с н и

тсльствует о том, что токсические компоненты сульфитного щелока в указанной концентрации не оказывают инги-Штамм микромицета PaecLlomvces

бнруюпего нозлействия на P.varLotii variotii BKMF-3091D, используемый

КРЗ и выступают в качестве источниковШ1Я очистки сточных вод от фенолов

пополнительного углеролного питания.цли лигнина.

f. 71683l

Формула изо G p P т с н и я

-Штамм микромицета PaecLlomvces

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма гриба PAECILOMYCES VARIATII, который способен осуществлять быструю и эффективную биологическую очистку сточных вод от фенолов лигнина и его производных на предприятиях целлюлозно-бумажной промышленности. Целью изобретения является сокращение продолжительности очистки и повышение ее эффективности. Штамм выделен из гидролизного лигнина, взятого из отвалов Бобруйского гидролизно-дрожжевого завода, путем получения накопительной культуры, последующего рассева ее на чашки с агаризованной минеральной средой с фенолами (300 мг/л) и отбора наиболее активного варианта. Штамм разлагает гваякол, фенол, ванилин, бензойную, м-метоксибензойную кислоты в концентрации 150 мг/л за 12 - 20 ч культивирования на качалке при 30°С. Активное расщепление лигнинов культурой P. VARIOTII начинается с 24 ч роста и за 3 сут концентрация диоксан-лигнина в среде снижается на 30%, а лигнина Класона на 30%. 3 табл. 1 ил.

Таблица 1

Таблица2

3,5 1,9

Таблица 3

0,049 0,026

31,0 30,0