СПОСОБ СИНТЕЗА НУКЛЕОЗИД-5'-ТРИФОСФАТОВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ ФОСФОРА В АЛЬФА-ПОЛОЖЕНИИ Российский патент 2009 года по МПК C12P19/38 C07H19/10 C07B59/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 (фосфором-33) в альфа-положении, и может быть использовано для исследований в области молекулярной биологии, генетики и медицинской биохимии.

Предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот, меченные радиоактивными изотопами фосфора, [α-³²⁽³³⁾P]NTP (нуклеозид-5'трифосфат, меченный фосфором 32 или 33) и [α-³²⁽³³⁾P]dNTP (2'-дезоксирибонуклеозид-5'трифосфат, меченный фосфором 32 или 33), широко используются в фундаментальных и прикладных исследованиях по физико-химической биологии и биотехнологии. Практически все основные достижения в области молекулярной генетики, генетической инженерии, включая разработку методов расшифровки первичной структуры нуклеиновых кислот, основаны на использовании нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Известен способ синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении, состоящий в последовательном фосфорилировании меченого нуклеозид-5'-монофосфата до целевого соединения с помощью ферментного препарата нуклеозидмонофосфаткиназ. Способ заключается в инкубации меченого нуклеозид-5'монофосфата с ферментным препаратом в присутствии буферных компонентов, АТР (аденозин-5'трифосфат), и системы фосфорилирования нуклеозиддифосфата/регенерации АТР, состоящей из пируваткиназы (ЕС 2.7.1.40) и фосфоенолпирувата. Весь синтез длится 30-40 мин при 37°С, после чего проводят хроматографическую очистку целевого соединения (R.Hurlbert, N. Furlong "Methods Enzymol." Part A, 12, 193, 1967). Основной недостаток способа заключается в том, что используемый ферментный препарат нуклеозидмонофосфаткиназ представляет собой смесь белков, полученных сульфатаммонийным фракционированием лизата клеток E.coli. Примеси различных ферментов, а также других веществ, входящих в состав клеточного лизата, не позволяют стабильно достигать высокого выхода целевого продукта, а также снижают его молярную (специфическую) активность и затрудняют конечную очистку.

Известен способ получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении, с высокой молярной активностью, в котором вместо суммарного препарата нуклеозидмонофосфаткиназ Е. coli используют индивидуальные ферменты: аденилаткиназу (ЕС 2.7.4.3), гуанилаткиназу (ЕС 2.7.4.8), цитидилаткиназу (ЕС 2.7.4.14), тимидилаткиназу (ЕС 2.7.4.9) и уридилаткиназу (ЕС 2.7.4.22), выделенные из клеток E.coli (Ch.K. Bierbricher "Anal. Biochem.", 95, 419, 1979). Основным недостатком способа является необходимость предварительной наработки пяти чистых ферментов для синтеза, что значительно увеличивает стоимость всего технологического процесса.

Известен наиболее близкий к заявленному способ, в котором в ферментативной схеме получения нуклеозид-5'-[α-³²Р] трифосфатов используют для фосфорилирования коммерческие препараты аденилаткиназы, гуанилаткиназы и нуклеозидмонофосфаткиназы фирмы «Boehringer-Mannheim». Последний из вышеперечисленных ферментов (нуклеозидмонофосфаткиназа) является не индивидуальным белком, а смесью ферментов, полученных фракционированием гомогената печени быка (T.F.Walseth, P.S.T.Yuen, M.C.Moos "Methods Enzymol.", 195, 29, 1991).

Технологически этот способ аналогичен предыдущим как по составу реакционной смеси, так и по аппаратурному оформлению, и различия состоят в использовании других ферментов для первого фосфорилирования. Простота, быстрота и доступность коммерческих ферментных препаратов сделали этот способ привлекательным как для лабораторных синтезов, так и для промышленного производства.

Основным недостатком способа является то, что ферментный препарат нуклеозидмонофосфаткиназа является плохо очищенной смесью цитидилаткиназы, тимидилаткиназы и уридилаткиназы с примесью балластных белков и неспецифических дефосфорилирующих ферментов. Относительное содержание цитидилаткиназы, тимидилаткиназы и уридилаткиназы колеблется в различных партиях этого препарата в 10 и более раз. Это осложняет проведение синтезов и препятствует достижению стабильного выхода целевого продукта.

Изобретение решает задачу упрощения способа получения [α-³²⁽³³⁾P]NTP и

[α-³²⁽³³⁾P]dNTP и достижения стабильного выхода целевого продукта.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении, включающем обработку меченого нуклеозидфосфата в буферном растворе смесью нуклеозидмонофосфаткиназы и пируваткиназы с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, в качестве нуклеозидмонофосфаткиназы используют дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу бактериофага Т5.

Фермент дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу бактериофага Т5 (ЕС 2.7.4.13) синтезируют в клетках E.coli после заражения (инфекции) бактериофагом Т5 с последующим его выделением (Galina V. Mikoulinskaia, Sergei I.Gubanov, Andrei A.Zimin, Igor V. Kolesnikov, Sergei A. Feofanov, and Anatolii I. Miroshnikov. Protein Expression and purification, 2003, 27, 195-201).

Проведенные исследования показали, что фермент дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 способен фосфорилировать не только [5'-³²⁽³³⁾Р]dNMP (2'-дезоксинуклеозид-5'-монофосфат, меченный фосфором 32 или 33), но и [5'-³²⁽³³⁾Р]NMP (нуклеозид-5'-монофосфат, меченный фосфором 32 или 33). Для синтеза меченных фосфором соединений этот фермент дает хорошие результаты за 30 мин инкубации при 37°С. Последнюю стадию - фосфорилирование соответствующих дифосфатных производных до трифосфатных - осуществляют с помощью пируваткиназы.

Таким образом, технический результат заявленного способа заключается в упрощении процесса получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении, за счет использования вместо трех ферментов в известном способе (денозинмонофосфаткиназы, гуаназинмонофосфаткиназы и нуклеозидмонофосфаткиназы) одного универсального фермента в заявленном способе - дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5, также в стабилизации выхода целевого продукта. В известном способе выход целевых продуктов резко различается: для дезоксиаденозитрифосфата выход достигает 60%, для дезоксигуанозин-5'-трифосфата выход достигает 40%, а для тимидинтрифосфата колеблется от 10 до 40% в зависимости от качества нуклеозидмонофосфаткиназы, которую используют для синтеза. В заявляемом способе за счет использования дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 выход целевых продуктов повышается до 75-90%.

Способ осуществляют следующим образом.

В реакционную смесь, содержащую Трис-HCl буфер (рН 8,0); хлорид магния; хлорид калия; ДТТ (дитиотреитол); АТР и фосфоенолпируват, добавляют [5'-³²P]dCMP (2' дезоксицитидин-5'-монофосфат, меченный фосфором 32) или [5'-³³P]dAMP (2'дезоксиаденозин-5'-монофосфат, меченный фосфором 33), Т5-киназу и пируваткиназу. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин. Затем состав смеси анализируют ТСХ (тонкослойной хроматографией) на пластинке ПЭИ (полиэтиленимин)-целлюлозы в 0,5 М калий-фосфатном буфере (рН 4,0) для определения выхода реакции. После хроматографии пластинку высушивают и визуализируют с помощью фосфоиммиджера или авторадиографически. Выход реакции составляет 90% по радиоактивности. Целевой продукт из реакционной смеси выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) в ион-парном режиме на колонке С-18 в градиенте этанола.

Изобретение иллюстрируют примеры

Пример 1. Синтез [α-³³Р]dCTP (2'дезоксицитидин-5'[α-³²P]-трифосфата).

В реакционную смесь объемом 100 мкл состава:

50 мМ Трис-HCl буфер рН 8,0

5 мМ хлорид магния

0,2 М хлорид калия

5 мМ ДТТ

0,5 мМ АТР

5 мМ фосфоенолпируват

добавляют 10 мКи [5'-³²P]dCMP (примерно 2,5-3 нмоль вещества), 5 единиц активности дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 (Т5-киназы) и 5 единиц активности пируваткиназы. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин. Затем аликвоту (объемом 0,2-0,3 мкл) анализируют ТСХ на пластинке ПЭИ-целлюлозы в 0,5 М калий-фосфатном буфере рН 4,0 для определения выхода реакции. После хроматографии пластинку высушивают и визуализируют с помощью фосфоиммиджера или авторадиографически. Выход реакции составляет 90% по радиоактивности. Целевой продукт из реакционной смеси выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме на колонке С-18 в градиенте этанола. Конечный выход продукта [α-³²P]dCTP - 7,5 мКи (75%) от исходного соединения.

Пример 2. Синтез [α-³²P]ATP (аденозин-5'-[α-³²P-трифосфата).

В реакционную смесь объемом 100 мкл состава:

50 мМ Трис-HCl буфер рН 8,0

5 мМ хлорид магния

0,2 М хлорид калия

5 мМ ДТТ

0,005 мМ АТР

5 мМ фосфоенолпируват

добавляют 5 мКи [5'-³²P]AMP (аденозин-5'-монофосфата, меченного фосфором-32, примерно 1,5-2 нмоль вещества), 5 единиц активности Т5-киназы и 5 единиц активности пируваткиназы. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин. Затем аликвоту (объемом 0,2-0,3 мкл) анализируют ТСХ на пластинке ПЭИ-целлюлозы в 0,5 М калий-фосфатном буфере рН 4,0 для определения выхода реакции. После хроматографии пластинку высушивают и визуализируют с помощью фосфоиммиджера или авторадиографически. Выход реакции составляет 90% по радиоактивности. Целевой продукт из реакционной смеси выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме на колонке С-18 в градиенте этанола. Конечный выход продукта [α-³²Р]АТР - 4,5 мКи (90%) от исходного соединения.

Пример 3. Синтез [α-³³P]dATP (2'-дезоксиаденозин-5'-[α-³³P]-трифосфата).

В реакционную смесь объемом 100 мкл состава:

50 мМ Трис-HCl буфер рН 8,0

5 мМ хлорид магния

0,2 М хлорид калия

5 мМ ДТТ

0,5 мМ АТР

5 мМ фосфоенолпируват

добавляют 10 мКи [5'-³³P]dAMP (примерно 2,5-3 нмоль вещества), 5 единиц активности Т5-киназы и 5 единиц активности пируваткиназы. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин. Затем аликвоту (объемом 0,2-0,3 мкл) анализируют ТСХ на пластинке ПЭИ-целлюлозы в 0,5 М калий-фосфатном буфере рН 4,0 для определения выхода реакции. После хроматографии пластинку высушивают и визуализируют с помощью фосфоиммиджера или авторадиографически. Выход реакции составляет 90% по радиоактивности. Целевой продукт из реакционной смеси выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме на колонке С-18 в градиенте этанола. Конечный выход продукта [α-³³P]dATP - 8.5 мКи (85%) от исходного соединения.

Пример 4. Синтез [a-³²P] CTP (цитидин-5'-[α-³²Р]-трифосфата).

В реакционную смесь объемом 100 мкл состава:

50 мМ Трис-HCl буфер рН 8,0

5 мМ хлорид магния

0,2 М хлорид калия

5 мМ ДТТ

0,5 мМ АТР

5 мМ фосфоенолпируват

добавляют 6 мКи [5'-³²P]CMP (питидин-5'-монофосфата, меченного фосфором-32, примерно 2-3 нмоль вещества), 10 единиц активности Т5-киназы и 5 единиц активности пируваткиназы. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин. Затем аликвоту (объемом 0,2-0,3 мкл) анализируют ТСХ на пластинке ПЭИ-целлюлозы в 0,5 М калий-фосфатном буфере рН 4 для определения выхода реакции. После хроматографии пластинку высушиают и визуализируют с помощью фосфоиммиджера или авторадиографически. Выход реакции составляет 90% по радиоактивности. Целевой продукт из реакционной смеси выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме на колонке С-18 в градиенте этанола. Конечный выход продукта [α-³²P]CTP - 5,0 мКи (80%) от исходного соединения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 (фосфором-33) в альфа-положении, и может быть использовано для исследований в области молекулярной биологии, генетики и медицинской биохимии. Способ осуществляют путем обработки меченого нуклеозидфосфата в буферном растворе смесью дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 и пируваткиназы с последующей хроматографической очисткой целевого продукта. Изобретение решает задачу упрощения способа получения дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и достижения стабильного выхода целевого продукта.

Способ синтеза дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении, включающий обработку меченого нуклеозидфосфата в буферном растворе смесью нуклеозидмонофосфаткиназы и пируваткиназы с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве нуклеозидмонофосфаткиназы используют дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу бактериофага Т5.