Способ получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 @ -трифосфатов, меченных изотопами @ С и @ Н Советский патент 1989 года по МПК C07H19/10 C07H19/20 

трис-HCl рН 7,3, содержащем 2 мМ 2- меркаптоэтанола, до конечной концентрации стрелтомицинсульфата 3%. После этого смесь перемешивают при 2-5 С в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 40 мин при 12000 об/мин. Осадок отбрасывают. К супернатанту при тщательном перемешивании на холоду присыпают небольшими порциями тон- корастертые кристаллы сухого сульфата аммоний до конечной концентрации 70% насыщения по сульфату аммония. Раство тщательно перемешивают в течение 30 мин на холоду, а затем центрифуги- руют в течение 30 мин при 10000 об/ми Супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют в минимальном объеме раствора сульфата аммония с концентрацией 70% от насыщения в 0,05 М трис-НС рН 7,5, содержащем 2 г 2-меркапто- этанола. Суспензию разбавляют в 2,5 раза с буфером и тщательно перемешивают на холоду в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 30 мин при 12000 об/мин. Осадок отбрасывают. Супернатант подтитровьшают с 0,5 н КОН до рН 7,5 и используют как комплексный ферментный препарат. Получен- ньй ферментный препарат разливают по 5 мл в герметичные полиэтиленовые флаконы и замораживают при -40 С. В таком виде препарат хранится 6 мес. без заметной потери активности.

Пример 2. Синтез рибонукле- озид- и дезоксирибонуклеозид-5 -три- фосфатов, меченных изотопами С и н, с использованием комплексного ферментного препарата.

Перед использованием в синтезе комплексный ферментный препарат иммобилизуют известным способом на Br-CN- Сефарозе. Для этого 5 мл ферментного препарата размораживают на льду, обессоливают (от сульфата аммония) на колонке с Сефадексом Г-25 (1,6смх X АО см) с одновременной заменой бу фера на О,1 М К-фосфат рН 7,8, содержащий 0,5 М КС1 и 2 мМ 2-меркапто- зтанола. В последнем буфере проводят иммобилизацию при соотношении белка и матрицы 15 мг/г сухой матрицы. Хранят иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) в 0,01 М трис-НС рН 7,5, содержащем 2 мМ 2-меркапто- этанола, при 2-5°С в герметичной по- суде в течение А недель без потери активности.

а) Синтез уридин-5 - трифосфата.

Реакционную смесь, содержащую в I МП 2 мкмоль С- или Н-уридин-5 - -монофосфата 0,2 мкмоль АТФ, 20 мкмоль ацетилфосфата, 4 мкмоль MgCl, 50 мкмоль трис-НС1 рН 7,5, ИФП, содержащего 0,4 мг белка, инкубируют в термостатируемой встряхиваемой кювете при в течение 2 ч. Затем реакционную смесь отделяют от ИФП на стеклянном фильтре, упаривают при 30°С на ротационном испарителе до объема около 0,1 мл и наносят на пласт; ны Силуфола УФ-254 (15 см х к 15 см), предварительно промытые ацетоном и высушенные в вакуумном эксикаторе. Проводят восходящую хроматографию в системе 1,4-диоксан - 5 М аммиак - I М ацетат аммония (43:54:3 Зоны расположения нуклеотидного материала идентифицируют под ультрохемис- копом; полосы, содержащие или П-УТФ, вырезают и элюируют или Н-УТФ с пластины водой. Элюат фасуют во флаконы, добавляют этанол до концентрации 50% и хранят при . Выход С или Н-УТФ в синтезе составляет 94-96%.

б)Синтез аденозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль или П-адено- зин-5 -монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход С- или Н-АТФ в синтезе составляет 82-89%.

в)Синтез гуанозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль или Н-гуано- зин-5 -монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход или Н- ГТФ в синтезе составляет 82-89%.

г)Синтез цитнцин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль или Н-цити- дин-5 -монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход или Н-ЦТФ в синтезе составляет 70-72Х.

д)Синтез дезоксиаденозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- илм Н-дезок- сиаденознн-5 -монофосфата. Вместо АТФ в качестве донора фосфатных групп в реакционную смесь вносят дАТФ. В

остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Вьпсод С- или Н-дАТФ в синтезе составляе 81-83%.

е)Синтез дезоксигуанозин-5 -три фосфата,

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль или Н-дезокс гуанозин-5 -монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход С- или Ж-дГТФ в синтезе составляет 90-92%.

ж)Синтез дезоксицитидин-5 -трифофата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль с- или н-дезок- сицитидин-5 -монофосфата. Б остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход или Н-дЦТФ в синтезе составляет 62- 65%.

з)Синтез дезокситимндин-5 -трифосфата .

В качестве меченого субстрата используют 2 мкыолъ или Н-дезок

ситимидин-5 -монофосфата. Хроматогра

Составитель Ю. Голова Редактор Н. Корченко Техред М.ХоданичКорректор в. Кабаций

Заказ 6865Тираж J39Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-нздательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

фию реакционной смеси на пластинах Силуфол УФ-25А проводят в системе изомасляная кислота - 5 М аммиак - вода (57:4:39). Полосу Силуфола УФ- 254, содержащую или Н-ТТФ промывают этанолом для удаления следов изомасляной кислоты, высушивают и затем элюируют целевой продукт водой. В остальном процесс синтеза н очистки конечного продукта аналогиче описанному для уриднн-5-трифос6ата. Выход или Н-дТТФ в синтезе составляет 88-82%.

Amersham.

Радиохимическая чистота полученных препаратов составляет 94-96%. Основные характеристики УФ-спектров полученных рибонуклеозид- н дезоксирибо- нуклеозид-5 -трифосфатов соответствуют характерным для них. Полученные препараты С-АТФ и С-УТФ были испытаны в ферментативной снстеме РНК-по- лимеразы Е. coli, а препарат С-дТТФ- в системе терминальной дезоксинуклео- тидилтрансферазы из тимуса теленка. Во всех случаях включение полученных С-нуклеозид- -трифосфатов не уступает включению аналогичньсх препаратов