СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ "С-УРИДИН-Б^-ТРИФОСФАТА Советский патент 1973 года по МПК C07D239/54 C07D405/04 C07B59/00 

1

Изобретение относится к способу получения мечеиых нуклеотидов, именно к новому способу получения 1 С-уридин-51-трифосфата.

Это соединение иримеияется в биохимических исследованиях.

Известен способ иолучення 1-4С-уридии-51трифосфата путем ферментативного фосфорилирования 11С-уридин-51-монофосфата. Однако этот способ характеризует высокая стоимость и трудность синтеза исходного продукта.

С целью упрощения процесса за счет применения более доступного исходного продукта предложено в качестве последнего использовать С-урацил, а в качестве катализатора - ферментную фракцию бесклеточного экстракта Escherichia соИ АВ 259 3000. Процесс проводят в присутствии D - рибозы, аденозии-51-трифосфата, ионов Mg2+, а также системы, регенерирующей аденозин-51-трифосфат, пируваткиназы и фосфоенолпирувата, при рН 7,7-7,9.

Процесс протекает при 37°С в течение 4 час. Выход 11С-уридин-51-трифосфата (по урацилу)-90-95%. Радиохимическая чистота получеииого препарата - 95%.

Пример. Приготовление бесклеточных экстрактов Е. соИ АВ 259 nfr 3000.

Клетки выращивают на пептоиной среде с интенсивной аэрацией при 37°С до средней

логарифмической фазы (7-SXO- клеток/лгл), осаждают в центрифуге, отмывают от среды буферным раствором (0,01 М трпсИС1, рИ 7,8; 0,005 М MgCl.). Бесклеточные экстракты готовят растиранием клеток со стеклом при 1-2°С, разбавляют получе1П1ую массу двукратным объемом буфера (0,2 Л1 трис-ПС1, рН 7,8; 0,05 М MgCb), вносят дезоксирпбонуклеазу (0,01 мг/мл раствора), цептрифугируют 20 мин при 10000 об/мин в низкоскорост юй центрифуге. Падосадочную жидкость подвергают ультрацеитрифугпрованию при 100000 g в течение 1 час. Полученные экстракты быстро замораживают и хранят при -20°С. Непосредственно перед внесением в реакционную смесь бесклеточные экстракты нагревают при 50°С (в водяной бане) 3 мин, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость используют в качестве фермеитной фракции Е. соИ.

Синтез С-уридин-5-трифосфата. Реакционную смесь, содержащую (в мкмоль/мл): 1 С-урацила - 1,8; D-рибозы - 9,0; адеиозин51-трифосфата- 1,5; фосфоенолпирувата - 10; трис-НС1-100; MgCb--25; пируваткипазы - 30 мкг; бесклеточного экстракта - 0,14 мл на 1 мл реакционной смеси (рН 7,8), инкубируют 4 час при 37°С (в водном термостате) . По истечении 3,5 час инкубации дополнительно вносят (на 1 М.Л смеси): 1,5мкмоль адеиозин-б -трифосфата, IQмкмоль фосфоенолпирувата и 30 мкг пируваткиназы. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на 3 /иин. Образовавшийся осадок-удаляется в иизкоскоросткой центрифуге, а надосадочная жидкость (после концентрировании в ротационном испарителе при 32°С) наносится на бумагу W 15/10 ОЕзео на 1 сл( старта) для хроматографирования в системе изомасляная кислота - вода - . гидроокись аммония (66:33:5) нисходящим способом в течение 20 час. Хроматограммы сущат в струе холодного воздуха (2-3 час), отмывают в нисходящем токе эфира при 3- 4°С в течение , зоны С-уридин-б -трифосфата вырезают и элюируют водой, полученный раствор концентрируют в ротационном испарителе (32°С), замораживают и хранят при -20°С. Выход конечного продукта (по урацилу) - 90-95%. Полученный С-уридин-51-трнфосфат анализируют хроматографическн в системах: i) этанол - 1 М ацетат аммония - ОД М ЭДТА (75:29:1), восходящая, 18 час; 2) изомасляная кислота - вода - конц. гидроокись аммония (66:33:1,5), нисходящая, 18 час; а также электрофоретическн (0,05 М цитратный буфер, рН 5,0; 150/см. 1,5 час). Подвижностп (Rf - для хроматограмм, Е - для электрофореграмм) полученного пренарата в указанных случаях найдены аналогичными таковым для стандартных образцов уридин-51-трифосфата (Reanai, Венгрия). Радиохимическая чистота пренарата составляет 95%. Основные характеристики УФ-спектра полученного препарата соответствуют характерным для уридин-51-трифосфата. График, где по оси абсцисс отлол ено время реакции (в мин), а по оси ординат - процент iC-урацила, превращенного в С-уридин-51трифосфат, показывает, что при описанных условиях реакции уже за 3 час инкубации практически весь 1- С-урацил превращается в 1С-уридин-5 -трифосфат. Предмет изобретения Способ получения С-урнднн-б -трифосфата путем ферментативного синтеза, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве исходного продукта используют С-урацил, в качестве катализатора применяют ферментную фракцию бесклеточного экстракта Escherichia coli АВ259 Hfr 3000, и процесс проводят в присутствии D-рибозы, аденозин-51-трнфосфата, ионов Mg, пируваткиназы и фосфоеиолпнрувата при рН 7,7-7,9.