СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и может найти применение в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии.

Известен способ праймирования для определения последовательностей ДНК и РНК, включающий применение праймеров в виде олиго- или полинуклеотидов, содержащих в своем составе природные нуклеозиды А, Г, Ц и Т (Sangler F, Nicklen S. Coilson A.P. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1977, v 74, p. 5463-5467).

В процессе праймирования участвуют: матрица в виде цепи ДНК, праймер в виде олиго- или полинуклеотида и нуклеозидтрифосфаты. Катализатором служит ДНК-полимераза. При этом праймер является таким олиго- или полинуклеотидом, который комплементарен к определенному участку матрицы и образует с нею в этом участке двухцепочечную структуру дуплекс. Праймер служит инициатором синтеза новой цепи ДНК. В процессе праймирования происходит удлинение его цепи путем последовательного присоединения его 3' концу нуклеотидов из нуклеозидтрифосфатов. В результате праймирования образуется двухцепочечная структура, состоящая из ДНК-матрицы и комплементарной к ней вновь синтезированной цепи ДНК.

В данном известном способе использованы праймеры, не содержащие какой-либо метки, но нуклеозидтрифосфаты содержат метку ³²P.

Недостатком данного известного способа является то, что он приводит к значительному неспецифическому включению метки во вновь синтезируемую ДНК, что связано с неспецифическим праймированием мелкими фрагментами ДНК, присутствующими в качестве примеси в матрице, или с самопраймированием.

Известен способ праймирования, включающий применение праймеров, состоящих из природных нуклеозидов и содержащих метку ³²p по 5'-концевому звену (Megrow R.A. Anal. Biochem. 1984, v.143, p. 298) (прототип).

Данный известный способ позволяет избежать неспецифическое включение метки в синтезируемый продукт, поскольку метка заранее включена в праймер. Кроме того, преимуществом использования меченого праймера является более равномерное распределение метки между образующимися при секвенировании фрагментами и отсутствие радиолиза получаемых фрагментов, которые содержат только концевую и не содержат внутренней метки.

Оба известные способа реализуются при температуре 37^oC, при которой дуплекс, образуемый праймером с матрицей, стабилен, поскольку температура плавления (Т_пл) дуплексов, образуемых олигонуклеотидами длиной по 20 звеньев, невысока. Однако при такой температуре возможны ошибки, связанные со вторичной структурой, которую образует матрица при данной пониженной температуре. В этих условиях вторичная структура матрицы может препятствовать полимеразному копированию матрицы.

Избежать эти ошибки можно, проводя праймирование при повышенной температуре.

Так, известен способ праймирования для секвенирования при повышенной температуре (70-80^oC). При этом также используют праймеры в виде олигонуклеотидов, состоящих из природных нуклеозидов, и термостабильную ДНК-полимеразу (Jnnis M.A. Myambo K.B. Golfand D.H. Brow M.A.D. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1988, v. 85, p. 9436-9440).

Способ позволяет избежать нежелательных эффектов, связанных со вторичной структурой матрицы. Однако применяемая при этом температура реакционной смеси превышает температуру плавления образующегося дуплекса, что, со своей стороны, снижает эффективность включения праймера в молекулу вновь синтезируемой ДНК, следствием чего является удлинение времени анализа. Этот недостаток данного известного способа еще более выражен при использовании для мечения вместо ³²p более мягкого и удобного в работе изотопа фосфора ³³p, который труднее фиксируется при радиоавтографии.

Известен способ праймирования, включающий применение меченых праймеров в виде олигонуклеотидов, состоящих из природных нуклеозидов, предусматривающий проведение многократного циклического праймирования, за счет чего эффективность использования меченого праймера повышается (Murray V. Nucl. Acid Res. 1989, v. 17, p. 8889).

Однако данный известный способ требует использования специальных автоматических устройств для проведения нескольких циклов праймирования.

Все вышеизложенное относится также к использованию праймирования в полимеразной цепной реакции.

Вышеприведенный анализ известных способов позволил высказать предложение о целесообразности поиска таких праймеров, которые образуют с матрицей дуплексы с повышенной стабильностью, отражающейся в повышении Т_пл дуплекса. Выявление таких праймеров позволит облегчить образование дуплекса между праймером и матрицей при повышенной температуре и повысить эффективность использования праймера при сохранении специфичности праймирования и без использования специальных технических автоматизированных средств. Повышение эффективности праймирования, в свою очередь, должно облегчить применение праймеров, меченных ³³P, вместо используемых ³¹P-олигонуклеотидов, что важно с точки зрения разрешающей способности секвенирующих экспериментов, безопасности исследователей, работающих с мечеными продуктами, а также с точки зрения охраны окружающей среды.

Известен прием замены в олигонуклеотидах природных нуклеозидов их модифицированными аналогами. Так, при гибридизации по Саузеру был использован модифицированный олигонуклеотид, содержащий 5-метилдезоксицитидин (м⁵Ц) вместо дезоксицитидина, что позволило получить более интенсивную картину при большой селективности реакции (Hoheisel J.D. Craig A.G. Lehrach H. J. Biol. Chem. 1990, v.265, p.16656-16660).

Известно использование олигонуклеотидов, модифицированных 2-аминоаденином (ам²A) при конструировании гибридизационных проб (Ehollett A. Kowachima E. Nucl. Acid Res. 1988, v.16, p.305-317) 6, и для аффинной селекции комплементарных последовательностей (Lamm G.M. Blencome B.Y. Spront B.S. Iribarren A.M. Ryder U. Lamond A.Z. Nucl. Acid Res, 1991, v. 19, p.3193-3198).

Такая модификация олигонуклеотидов в данных известных способах позволила достичь более эффективного образования дуплексов и улучшить результаты по сравнению с использованием олигонуклеотидов, состоящих из природных нуклеозидов.

Однако применение модифицированных олигонуклеотидов в качестве праймеров не описано. К тому же известные модифицированные олигонуклеотиды содержат лишь один тип модифицированных азотистых оснований, и поэтому максимальная стабильность дуплексов не достигается.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является повышение температуры плавления образующихся при праймировании дуплексов, как следствие замены нормального праймера модифицированным. Это сопровождается повышением прочности образующихся дуплексов, причем тем более выраженной, чем большее количество азотистых оснований заменено их модифицированными аналогами. Повышением эффективности инициации синтеза ДНК, снижением влияния вторичной структуры матрицы на результат матричного копирования.

Практически важным следствием этого является повышение эффективности использования праймеров при секвенировании и в полимеразной цепной реакции, что улучшает чувствительность и специфичность анализа и позволяет использовать меченные ³³P праймеры с большим эффектом, чем при использовании в качестве праймеров немодифицированных олигонуклеотидов. При этом повышается информативность способа, сокращается время анализа и обеспечивается возможность прочтения более длинных последовательностей, снижается загрязнение окружающей среды радиоактивными соединениями за счет обеспечения возможности использования их в значительно меньших количествах, чем при реализации способа праймирования с использованием немодифицированных олигонуклеотидов.

Достигается это тем, что в способе праймирования, включающем использование праймеров в виде олиго- или полинуклеотидов, используют олиго- или полинуклеотиды, содержащие химически модифицированные азотистые основания, преимущественно олиго- или полинуклеотиды, в которых модифицировано два или более типов азотистных оснований.

В настоящем изобретении впервые использованы модифицированные олигонуклеотиды, в том числе и известные, при реализации способа праймирования.

В настоящем изобретении впервые получены и использованы в качестве праймеров олигонуклеотиды, в которых модифицировано два типа азотистых оснований и впервые установлено, что переход от модифицированных олигонуклеотидов с одним типом химически модифицированного азотистого основания к олигонуклеотидам с двумя типами азотистых оснований, имеющих ту или иную химическую модификацию, приводит к повышению прочности образующихся в процессе праймирования дуплексов, к повышению их Т_пл, что обеспечивает целый ряд преимуществ таких праймеров.

Ниже приведены примеры реализации нового способа.

Пример 1.

Синтез модифицированных праймеров и результаты определения их Т_пл.

Модифицированные олигонуклеотиды получены по известной методике (Sinho N. D. Biernat J, Memanus J, Koster H. Nucl. Acid Res, 1984, v.12, p.9539). При этом вместо стандартных синтонов защищенных нуклеозидов А и Ц использовали их модифицированные аналоги ам²A и м⁵С.

Температуру плавления указанных в таблице 1 олигонуклеотидов 1-3 определяли на приборе Jasco 7850 по кривой температурной зависимости поглощения при 260 нм раствора праймера и комплементарного олигонуклеотида: ГЦАЦТГГЦЦГТЦГTTTАЦААЦГТ в буфере ТМ: 10 М трис-HCl pH 8,0; 10 M MgCl₂. Температура плавления раймаеров 4,5 были рассчитаны по результатам определения T_пл праймеров 1-3.

Приведенные в таблице 1 данные показывают, что замена природного азотистого основания его химически модифицированным аналогом приводит к повышению температуры плавления олигонуклеотида. Замена на модифицированные аналоги двух типов азотистых оснований вызывает дальнейшее повышение температуры плавления олигонуклеотида.

Пример 2.

Праймирование для определения набора специфических фрагментов генома микроорганизмов.

Праймеры 4 и 5 применялись для выявления таксономической специфичности микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции с использованием праймера произвольной последовательности (Williams J.C.K, Kulelit A.R. Livak K. J. Rafalski J.A. Tingeg S.A. Nucl. Acid Res, 1990, v.18, N.22, p.6531-3535). Определения были выполнены для лабораторных штаммов E.Coli и S.tipbymurinm, а также для клинических изолятов и выделенных штаммов Helicobacter pilory, Bordetella peztussis и B. bronclrioseptica, Francisella sp. Для каждого из штаммов был получен характеризующий патерн фрагментов полимеразной цепной реакции. Сравнительный анализ результатов, полученных с помощью нормального и модифицированного праймеров, показал, что для большинства случаев применение модифицированного праймера позволяет получить большее число фрагментов ДНК. Число фрагментов, отличающих данный род, вид или штамм микроорганизма, при этом также увеличивается т.е. повышается информативность метода. Вторым важным результатом при использовании модифицированного праймера является полное воспроизведение характеризующих патернов в условиях повышения температуры отжига до 60^oC, а для ряда гемонов и до 65^oC, когда нормальный праймер не способен праймировать реакцию. Таким образом был предложен новый режим определений, сокращено время анализа и повышена его информативность.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что модифицированные праймеры могут найти применение в генетике, селекции, медицинской диагностике благодаря более быстрой и простой технике проведения определений и повышению информативности, достигаемых за счет повышения прочности связывания модифицированного праймера с матрицей и эффективного праймирования с большего числа участков генома организма.

Пример 3.

Секвенирование с использованием новых модифицированных праймеров.

Определение первичной структуры ДНК проводили по известной методике (Jnnis M. A. Myambo K.B. Gelfand D.H. Brow M.A. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1988, v. 85, pp.9436-9440). В качестве матрицы использовали одноцепочечную ДНК бактериофага М13mp18. Затравками служили перечисленные в таблице 1 олигонуклеотиды 1-3. Радиоактивную метку вводили в праймеры кинированием по стандартной методике. В таблице 2 приведены результаты денситометрического анализа полученных радиоавтограмм на приборе System 3, программа SCAN 1000.

Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что модифицированные праймеры более эффективно инициируют синтез ДНК по сравнению с аналогичными праймерами, содержащими нормальные нуклеиновые основания, причем праймеры с двумя модификациями проявляют более выраженные улучшенные свойства. Установлено, что специфичность инициации сохраняется при замене в праймерах нормальных нуклеиновых оснований их модифицированными аналогами: картина распределения полос на радиоавтографах во всех случаях была одинаковой. Установлено также, что эффективность инициации возрастает с возрастанием прочности связывания с матрицей.

Полученные результаты позволяют также сделать предположение о том, что повышение эффективности праймирования при использовании новых праймеров согласно изобретению должно давать возможность прочтения более длинных последовательной по сравнению с применением известных праймеров.

Приведенные в таблице 2 данные позволяют сделать вывод о том, что повышение эффективности праймирования модифицированными праймерами может найти практическое применение в секвенировании, особенно в тех случаях, когда реакция проводится при повышенных температурах, что целесообразно для уменьшения влияния вторичной структуры ДНК на результат матричного копирования.

Показано, что использование праймеров с той или иной меткой (радиоактивной, флуоресцентной, окрашенной, биотиновой или в виде белковых конъюгатов) повышает чувствительность определения, что позволяет в 4-5 раз снизить расход материала. С другой стороны, переход от меченых радиоактивной меткой известных праймеров, содержащих немодифицированные нуклеиновые основания, к используемым согласно изобретению более эффективным новым праймерам, содержащим модифицированные аналоги, позволяет значительно снизить загрязнение окружающей среды радиоактивными соединениями за счет возможности их использования в значительно меньших количествах.

Назначение: биотехнология, молекулярная биология, генетика, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: для получения нуклеиновой кислоты используют олиго- или полинуклеотиды, содержащие модифицированные азотистые основания, в частности, 5-метилдезоксицитидин и 2-аминоаденин. Замена двух и более типов оснований химически модифицированными приводит к повышению эффективности способа. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий инкубацию матричной одноцепочечной нуклеиновой кислоты, олиго- или полинуклеотида, комплементарного одному из ее участков, и набора мононуклеозидтрифосфатов в присутствии полимеразы нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что используют олиго- или полинуклеотиды, содержащие химически модифицированные азотистые основания. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что олиго- или полинуклеотиды содержат два или более модифицированных азотистых основания. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что химически модифицированные основания представляют собой 5-метилдезоксицитидин и/или 2-аминоаденин.