МОДИФИЦИРОВАННАЯ СУХАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА КМАФАнМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к средствам микробиологического контроля для определения общей бактериальной обсемененности при контроле безопасности и качества продуктов питания. Изобретение может быть использовано как средство микробиологического контроля при оценке бактериальной обсемененности производства, сырья, производственного процесса и готовой продукции.

При контроле общей бактериальной обсемененности принято определять наиболее значимую и многочисленную группу микроорганизмов, а именно, количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Поэтому питательная среда должна обеспечивать оптимальный рост и развитие именно этой группы микроорганизмов. Однако предлагаемая среда (среда КМАФАнМ) является питательной средой общего назначения, не имеющей в своем составе факторов, ограничивающих рост и развитие какой-либо определенной группы микроорганизмов. При изменении техники посева и условий культивирования предлагаемая питательная среда может быть использована для выявления иных групп микроорганизмов.

Известно использование в качестве азотистой основы питательных сред для определения общего количества бактерий гидролизатов белкового сырья (мяса, рыбы, рыбных отходов и др.) (Каталог сухих питательных сред, выпускаемых в СССР для медицинской микробиологии. Вып 1. М., 1980, с.7; Каталог «Бактериологические питательные среды», Оболенск, Министерство Здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, 2004, стр.7-8).

При использовании таких сред для контроля молока и молочных продуктов, как правило, не происходит полного выявления присутствующей в исследуемых образцах микрофлоры. Так, значительную часть бактериального пейзажа молока и молочных продуктов составляют молочнокислые микроорганизмы, для индукции развития которых необходимы специфические компоненты (азотистые вещества, полипептиды, пептиды, аминокислоты, витамины, углеводы, микроэлементы и неидентифицированные факторы роста), источниками которых является молоко-сырье.

Известна питательная среда для определения общего количества бактерий в молоке и молочных продуктах (Экспресс-информация "Маслодельная и сыродельная промышленность", Москва, 1976, №13, с.11-12), которая содержит в качестве азотистой основы кислотный гидролизат казеина, углеводной основы - глюкозу, источника витаминов - витамин В - комплекс, а также агар и дистиллированную воду. Однако кислотный гидролизат казеина в качестве азотистой основы не обеспечивает оптимального выявления бактерий, способных давать рост в молоке и молочных продуктах.

Известна питательная среда для определения общего количества бактерий, имеющая в качестве азотистой основы сухое гидролизованное молоко, получаемое из обезжиренного молока посредством ферментативного гидролиза панкреатином (Н.М.Гостищева. Использование сухих питательных сред для микробиологического контроля в молочной промышленности. Обзорная информация. ЦНИИТЭИ, Москва, 1983, с.14-22). Данная среда используется в настоящее время в качестве среды для определения общего количества бактерий в молоке и молочных продуктах по действующему ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа». К основе добавляется порошковый агар.

Недостаток среды состоит в том, что при посеве молочных продуктов образуются мелкие колонии, трудно подлежащие подсчету из-за недостаточного содержания факторов роста и буферности среды.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является модификация используемой сухой питательной среды для определения общего количества бактерий в отношении оптимизации ее состава, повышения уровня стандартности, улучшения ростовых и физико-химических характеристик.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в составе питательной среды для определения общего количества бактерий, включающей азотистую основу и агар, согласно изобретению, в качестве азотистой основы используют гидролизат белков молока, полученный комплексом гидролитических ферментов, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Ферментативный гидролизат белков молока 50,0-54,0 Лактоза 20,0-24,0 Дрожжевой автолизат 4,0-4,2 Калий фосфорнокислый двузамещенный 1,9-2,1 Агар 24,0-30,0

Комплекс гидролитических ферментов, используемый для получения ферментативного гидролизата белков молока по технологии, разработанной ВНИИ маслоделия и сыроделия (г.Углич Ярославской области), включает фосфатазу, ренниномезентерин и протосубтилин и обладает протеолитической и протеинфосфатазной активностью. Оптимизированные по сравнению с прототипом состав гидролизата и режимы его получения обеспечивают ростовые характеристики питательной среды, оптимальные для роста и развития большей части микроорганизмов.

Используемый гидролизат обеспечивает в приготовленной по предлагаемому изобретению питательной среде КМАФАнМ большее, чем в прототипе, содержание аминного азота (0,6 г против 0,25 г соответственно) (Свириденко Г.М., Свириденко Ю.Я., Перфильев Г.Д., Рогов Г.Н., Захарова М.Б, Абрамов Д.В. «Оптимизация режимов получения азотистой основы питательных сред, используемых для учета гетеротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в молоке и молочных продуктах». Тезисы докладов научно-технической конференции «Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия», Углич, 3-4 октября 1994 г., стр.196-199).

Использование ферментативного гидролизата белков молока в качестве азотистой основы обеспечивает новую питательную среду необходимыми углеводными компонентами молока, витаминами и минеральными солями.

В качестве фактора роста новая среда дополнительно содержит дрожжевой автолизат. Этот компонент повышают уровень аминного азота в среде и обогащают ее витаминами группы В. Определенный подбор факторов роста для данной среды обеспечивает сокращение времени появления колоний на рабочей питательной среде.

С целью увеличения буферной емкости среды, позволяющей получить колонии микроорганизмов, в том числе молочнокислых, большего размера, в состав среды включен калий фосфорнокислый двузамещенный.

Оптимальный качественный и количественный состав среды определен в результате большого объема экспериментальных исследований и практической работы отдела микробиологии ВНИИМС, а также большинства микробиологических лабораторий молочной отрасли, которые используют предлагаемую среду КМАФАнМ, разработанную и производимую ВНИИМС, для проведения микробиологического контроля.

Отличительной особенностью среды на основе полученного комплексом ферментов гидролизата белков молока являются ее улучшенные физико-химические характеристики, а именно:

- полная растворимость в воде, что исключает дополнительные операции (фильтрование) при приготовлении рабочей питательной среды по данному изобретению;

- не требуется доведения рН за счет высокой буферной емкости используемого гидролизата и калия фосфорнокислого двузамещенного (при применении питьевой воды для приготовления рабочей среды);

- готовая рабочая среда прозрачна и имеет определенное окрашивание, что облегчает учет количества и анализ характера образующихся колоний.

При соответствующих условиях культивирования на этой среде проводят наряду с выявлением мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определение общего количества психотрофных и термофильных микроорганизмов. Использование среды КМАФАнМ в качестве питательной основы позволяет определить протеолитические и липолитические бактерии, споровые аэробные микроорганизмы, а также цитратсбраживающие ароматообразующие микроорганизмы.

При развитии на предлагаемой среде любой из указанных групп микроорганизмов образуются характерные колонии на фоне прозрачной слабо окрашенной среды, что облегчает подсчет результатов, повышает их качество и точность и, следовательно, улучшает свойства среды по сравнению с прототипом.

Так, сравнительные исследования роста мезофильных лактококков как наиболее значимой группы микроорганизмов для молока и молочных продуктов показали, что на среде оптимизированного состава по предлагаемому изобретению выявляемость клеток лактококков несколько выше прототипа (1,71±0,33)×10⁹ и (1,57±0,30)×10⁹ КОЕ/см³ соответственно), а колонии лактококков, формируемые на предлагаемой среде, имеют больший средний диаметр, что доказывается статистическим анализом среднего диаметра колоний, проведенного путем распределения их в равноинтервальный вариационный ряд (см.таблицу).

Предлагаемая среда позволяет создавать оптимальные условия для роста и развития не только лактококков, наиболее требовательных к условиям роста и развития, но и других групп микроорганизмов за счет обеспечения их питательными веществами в нужном количестве и легкоусвояемой форме. Визуальное восприятие колоний на среде легче, так как размер их крупнее, чем на других аналогичных средах, что делает новую среду более привлекательной и эффективной для удобства подсчета колоний и получения более надежных результатов.

Промышленное производство ферментативного гидролизата, выпускаемого в виде сухого продукта стандартного химического состава во ВНИИМС, позволяет обеспечить высокий уровень стандартности в предлагаемой питательной среде КМАФАнМ для определения общего количества бактерий.

Для приготовления рабочей среды сухие компоненты смешивают с водой в количестве (50±5) г на 1 дм³ воды, тщательно перемешивают, подогревают до полного расплавления агара и кипятят 5 мин.

Пример

Для приготовления 10 кг сухой среды компоненты смешивают в смесителе для сухих веществ в следующем количестве: ферментативный гидролизат белков молока - 5,0 кг, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 кг, лактоза - 2,0 кг, дрожжевой автолизат - 0,4 кг, агар - 2,4 кг.

Готовый продукт представляет собой порошок тонкого помола сероватого цвета со специфическим запахом сухого гидролизата. Массовая доля сухих веществ составляет 94,0-96,0%.

Новая среда экономична, удобна в приготовлении и применении, в условиях герметичности может храниться до 12 месяцев в нерегулируемых температурных условиях.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как средство микробиологического контроля при оценке бактериальной обсемененности производства, сырья, производственного процесса и готовой продукции. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат белков молока, дрожжевой автолизат, калий фосфорнокислый двузамещенный, лактозу и агар. Изобретение позволяет повысить уровень стандартности и улучшить ростовые свойства питательной среды. 1 табл.

Модифицированная сухая питательная среда КМАФАнМ для определения общего количества бактерий, содержащая азотистую основу и агар, характеризующаяся тем, что она содержит при следующем соотношении компонентов, вес.%:
ферментативный гидролизат   белков молока 50,0-54,0 лактоза 20,0-24,0 дрожжевой автолизат 4,0-4,2 калий фосфорнокислый   двузамещенный 1,9-2,1 агар 24,0-30,0