ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/225 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред для выращивания лактобактерий, и может быть использовано в промышленном производстве лекарственных препаратов.

Уровень техники

Известна питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая аминокислотную основу, хлорид натрия, при этом в качестве аминокислотной основы используют аммиачно-ферментативный гидролизат отходов вакцинно-сывороточного производства и инкубаторного производства в виде глобулинов, или куриных эмбрионов, или сгустков крови, или фибрина, полученный путем аммиачного гидролизата измельченных смешанных с деминерализованной водой отходов и последующего гидролиза нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота до содержания аминного азота 500-700 мг % при следующем соотношении химических соединений, мас.%:

Пептон 1-2

Хлорид натрия 1,0-1,2

Аммонийные соли 0,03-0,1

а также, мг %

Общий азот 1100-1400

Аминный азот 200-220

Триптофан 80-200

(см. пат. RU № 2103345, кл. C12N 1/00, опубл. 27.01.1998 г.).

Недостатком данной питательной среды является высокая стоимость.

Известна питательная среда, основой которой является гидролизованное молоко, дрожжевой автолизат, агар, рН 6, при следующем соотношении химических соединений:

Гидролизованное молоко 1000 мл

Дрожжевой автолизат 3%

Агар 3%

(Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. Москва «Пищевая промышленность», 1975 - с. - 224).

Недостатком данной среды является ее низкая продуктивность.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является питательная среда для поверхностного и глубинного культивирования лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, агар-агар, стимулятор роста и дистиллированную воду (RU 2002113739 A1, 27.02.2004).

Недостатком данной среды является недостаточная питательная ценность для лактобактерий.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является получение качественной питательной среды на основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса с добавлением ферментативного гидролизата каллизии душистой в качестве стимулятора роста лактобактерий.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению количества колоний лактобактерий.

Технический результат достигается с помощью питательной среды для культивирования лактобактерий, содержащей питательную основу, глюкозу, агар микробиологический, стимулятор роста и дистиллированную воду, а в качестве питательной основы среда содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7-0,9%, а в качестве стимулятора роста - ферментативный гидролизат каллизии душистой при следующем содержании ингредиентов, мас.%:

Ферментативный гидролизат   говяжьего мяса   с содержанием аминного азота 0,7-0,9% 28,0-30,0 Ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,9-1,0 Глюкоза 18,0-20,0 Агар микробиологический 0,9-1,0 Дистиллированная вода остальное.

Сущность получения питательной среды для культивирования лактобактерий заключается в следующем.

Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют говяжье мясо, содержащее в среднем от 12,7% до 21,71% азотистых веществ, минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа; общее их количество достигает 1%. Мясо содержит также витамины, микроэлементы. Говяжье мясо содержит больше экстрактивных веществ, чем свежемороженое (Ю.А.Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз. 1950, с. 46).

Из белковых веществ в говяжьем мясе при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты, г/л: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серии, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин.

Глюкоза - источник углерода для обеспечения роста лактобактерий.

С целью стимулирующего эффекта в питательную среду добавляют ферментативный гидролизат из каллизии душистой.

Каллизия является одним из немногих комнатных растений, позволяющих рассчитывать на универсальность продукта ее гидролиза (гидролизата) за счет содержания многочисленных уникальных элементов, необходимых для роста и развития лактобактерий.

Каллизия душистая имеет следующий биохимический состав: каратиноиды, аскорбиновая кислота, флавоноиды, пектины, дубильные вещества, катехины. В каллизии также есть витамин С, витамин В2 (рибофлавин) и В15 (пантотеновая кислота), витамин РР (никотиновая кислота), микро- и макроэлементы: калий, кальций, железо, марганец, ванадий, никель, медь, цинк, галлий, бром, стронций, рубидий, цирконий, свинец, уран, торий (Золотой ус. / М.Н.Кедрова, 2006 г., с.7-80).

Приготовление питательной основы предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов заключается в следующем.

В варочный котел заливают 1,5 л водопроводной воды и доводят до кипения. Предварительно нарезанное говяжье мясо в количестве 1,00 кг загружают в кипящую воду и кипятят 15 мин, в процессе кипения снимают жир. Затем подогрев прекращают и оставляют для отстаивания на 20 мин. Мясо измельчают мясорубкой, мясную воду охлаждают до температуры 45±1°С, корректируют величину рН до значения 8,5±0,1 натрием углекислым. Мясной фарш в количестве 2,00 кг, мясную воду 5,00 л и поджелудочную железу крупного рогатого скота в количестве 0,20 кг помещают в 10 литровые бутыли, закрывают ватно-марлевыми пробками, накрывают пергаментной бумагой, укрепляют резиновыми кольцами. В качестве консерванта в бутыли добавляют хлороформ до конечной концентрации 1%.

Процесс гидролиза ведут в термокамере при температуре 37°С. Смесь перемешивают вручную через каждые 15 мин в течение 14 дней. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота и по достижении 0,7-0,9% подогрев прекращают, перевар отстаивают. Затем вручную фильтруют через тканевые фильтры. Сбор фильтрата проводят в стеклянные баллоны емкостью 10 л. Для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему фильтрата, закрывают резиновыми пробками, этикетируют и транспортирование проводят в холодовую камеру, где хранят при температуре от 2-8°С.

Способ приготовления стимулятора роста, в качестве которого используют ферментативный гидролизат каллизии душистой для выращивания лактобактерий, заключается в следующем. Побег каллизии душистой в количестве 200 г тщательно промывают в проточной водопроводной воде (предварительно поместив в марлю). Промытый субстрат перемалывают, помещают в стеклянную емкость и добавляют 600 мл (1:3) водопроводной воды, подогретой до температуры 45+1°С. Смесь расщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,2-8,3 по фенолфталеину. К общему объему содержимого добавляют 2% хлороформа и 10 таблеток пищеварительного ферментного средства - панкреатина, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом и помещают в термокамеру при температуре 45+1°С. Выдерживают в течение 10 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 5 минут. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат оставляют на сутки. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости. Полученный гидролизат имеет цвет сыворотки крови, показатель аминного азота - 0,075%; сухой остаток - 1,5%.

Примеры конкретного получения питательной среды для культивирования лактобактерий.

Эффективность исследуемых сред оценивали в соответствии с методическими рекомендациями «К контролю питательных сред по биологическим показателям. Москва, 1980, с использованием в качестве тест-штаммов лактобактерий L.plantarum 8P-A3, L.acidophilus EP 317-402.

Испытуемые культуры выращивают на пластинках плотного агара рН 6,8±0,1 при температуре 37°С в течение 2 суток. Из двухсуточных культур готовят 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равную 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до содержания в 1 мл 1000 м.к. Из данного разведения взвеси культур высевают по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного агара. Посевы инкубируют при 37°С в течение 5 суток при ежедневном просмотре. Через 24-120 ч учитывают результаты подсчетов выросших колоний.

Пример 1. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 100,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,6 мл; глюкозу 16,0; агар микробиологический 6,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма по 15 колоний.

Пример 2. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 200,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,8 мл; глюкозу 18,0; агар микробиологический 8,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма лактобактерий по 27 колоний.

Пример 3. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 280,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,9 мл; глюкозу 18,0; агар микробиологический 9,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма лактобактерий по 43 колонии.

Пример 4. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 300,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 1,0 мл; глюкозу 20,0; агар микробиологический 10,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма лактобактерий по 45 колоний.

Пример 5. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 400,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 1,2 мл; глюкозу 22,0; агар микробиологический 12,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма лактобактерий по 24 колонии.

Пример 6. Тест-штаммы выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 500,0; ферментативный гидролизат каллизии душистой 1,4 мл; глюкозу 24,0; агар микробиологический 14,0; дистиллированную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для лактобактерий при посевной дозе 10 м.к. составило в среднем для каждого тест-штамма лактобактерий по 14 колоний.

Полученные результаты позволяют определить оптимальные варианты питательной среды на основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса со стимулятором роста, в качестве которого используют ферментативный гидролизат каллизии душистой (пример 3, 4).

Таким образом, на основании вышеизложенного можно сказать о явных преимуществах предлагаемой среды, состоящей из ферментативного гидролизата говяжьего мяса 280,0-300,0; ферментативного гидролизата каллизии душистой 0,9-1,0; глюкозы 18,0-20,0; агара микробиологического 9,0-10,0, дистиллированной воды - остальное. Предлагаемая среда качественная, в основу берется ферментативный гидролизат говяжьего мяса, приготовленный на дистиллированной воде, со стимулятором роста.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- повышение качества питательной среды;

- возможность использования для культивирования широкого спектра микроорганизмов.

- может заменить сухие питательные среды для культивирования лактобактерий.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания лактобактерий, и может быть использовано в промышленном производстве лекарственных препаратов. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7-0,9%, ферментативный гидролизат каллизии душистой, глюкозу, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход лактобактерий.

Питательная среда для культивирования лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, агар микробиологический, стимулятор роста и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса с содержанием аминного азота 0,7-0,9%, а в качестве стимулятора роста - ферментативный гидролизат каллизии душистой при следующем содержании ингредиентов, мас.%:
ферментативный гидролизат   говяжьего мяса с   содержанием аминного азота 0,7-0,9% 28,0-30,0 ферментативный гидролизат каллизии душистой 0,9-1,0 глюкоза 18,0-20,0 агар микробиологический 0,9-1,0 дистиллированная вода остальное