СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГРУПП, ОБРАЗУЮЩИХ ГЕПАРИНЫ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/527 C07H15/10 

Настоящее изобретение относится к способу анализа специфических групп, образующих гепарины или низкомолекулярные гепарины.

При осуществлении способа получения Еноксапарина (Lovenox®) (US389618) из чистого гепарина, на стадии способа щелочной деполимеризации в водной фазе происходит частичное, но характерное преобразование глюкозаминов восстанавливающих концов олигосахаридных цепочек.

Первая стадия такой деполимеризации заключается в эпимеризации глюкозамин ↔ маннозамин (T.Toida and al, J.Carbohydrate Chemistry, 15(3), 351-360 (1996)), вторая стадия заключается в 6-0 десульфатировании глюкозамина с образованием производных, называемых “1,6-ангидро” (международная заявка на патент WO01/29055).

Производное такого типа получают только для олигосахаридных цепочек, конечный глюкозамин которых является 6-0 сульфатированным.

Процентное содержание олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро, является структурной характеристикой смеси олигосахарида Lovenox, и необходимо иметь возможность его измерения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу анализа гепаринов, низкомолекулярных гепаринов и более конкретно Lovenox.

Способ анализа согласно изобретению заключается в следующем.

Образец, количественное определение которого осуществляют, деполимеризуют под действием гепариназ, затем в случае необходимости, полученный деполимеризат восстанавливают, после чего проводят анализ путем высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Описанный выше способ, следовательно, отличается тем, что выявляют присутствие олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро (“группы 1,6-ангидро”).

Более конкретно, образец, количественное определение которого осуществляют, сначала подвергают исчерпывающей деполимеризации смесью гепариназ и, в частности, гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиаз II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.). (Эти ферменты выпускает фирма Grampian Enzymes). В международной заявке WO88/02400 описан способ деполимеризации гепарина с помощью гепариназы и нейтрализации антикоагулянтной активности гепарина, содержащегося в образце крови.

Таким образом, объектом изобретения является способ анализа гепаринов или низкомолекулярных гепаринов, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:

1) деполимеризация образца под действием гепариназ;

2) в случае необходимости, восстановление деполимеризата;

3) количественное определение посредством ВЭЖХ.

Более конкретно объектом изобретения является способ, описанный выше, отличающийся тем, что гепариназы представляют собой смесь гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиаз II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.).

Затем полученный таким образом деполимеризат обрабатывают предпочтительно раствором NaBH₄ в ацетате натрия. Эта последняя операция позволяет специфически восстанавливать восстановительные концы, которые не имеют форму 1,6-ангидро (продукты, описанные в заявке на патент WO 01/72762). Наконец, для количественного определения дисахаридов 1 и 2, описанных выше, образец низкомолекулярного гепарина должен быть восстановлен под действием восстановителя, такого, как NaBH_4.

Таким образом, более конкретно изобретение относится к способу, описанному выше, отличающемуся тем, что в качестве восстановителя используют NaBH₄. В случае необходимости, можно использовать другую соль щелочного металла - боргидрид, например, лития или калия.

Количественное определение концов 1,6-ангидро осуществляют посредством ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) и, в частности, анионообменной хроматографией.

Способ количественного определения согласно изобретению позволяет четко отличать Lovenox от других низкомолекулярных гепаринов, которые не содержат таких производных “1,6-ангидро”. И наоборот, способ количественного определения согласно изобретению позволяет убедиться в том, что низкомолекулярные гепарины не обладают физико-химическими свойствами Lovenox и, следовательно, имеют другую природу.

Способ количественного определения согласно изобретению можно применять при осуществлении промышленного способа для контроля образцов в процессе осуществления способа с тем, чтобы обеспечить стандартизацию способа производства Lovenox и получать однородную продукцию.

После ферментативной деполимеризации и восстановления восстановительных концов, производные 1,6-ангидро Lovenox представлены в 4 основных формах. Таким образом, изобретение относится также к способу, описанному выше, отличающемуся тем, что в ходе реакции деполимеризации получают следующие остатки 1,6-ангидро:

Все олигосахариды или полисахариды, имеющие конец 1,6-ангидро на дисахаридном концевом участке и не имеющие 2-0 сульфата на уроновой кислоте указанного концевого дисахарида, полностью деполимеризуются гепариназами в виде дисахаридов 1 и 2. И наоборот, если указанный концевой сахарид имеет 2-0 сульфат на уроновой кислоте и имеет форму маннозамина, производное 1,6-ангидро находится в виде тетрасахарида 1 (форма, устойчивая к гепариназам).

Трисахарид 1 (см. ниже) также входит в состав смеси. Он образуется в ходе другого процесса разложения, который приводит к образованию нижеуказанной структуры (явление peeling, наблюдаемый в процессе химической деполимеризации Lovenox.

Другие компоненты смеси не являются характерными только для Lovenox. Конечно, имеются 8 элементарных дисахаридов гепариновой цепочки. Эти 8 элементарных дисахаридов производит фирма Sigma.

Другие дисахариды были идентифицированы в смеси способом согласно изобретению: дисахариды ΔIIs_gal и ΔIVs_gal, которые образуются при 2-0 щелочной десульфатации -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- и -IdoA(2S)-GlcNS-, в результате которой образуются 2 галактуроновые кислоты. Они обычно не присутствуют в первоначальной структуре гепарина (U.M.Desai et Coll. Arch. Biochem. Biophys., 306(2) 461-468 (1993).

Олигосахариды, содержащие 3-0 сульфатированные глюкозамины являются устойчивыми в отношении расщепления гепариназами и остаются в форме тетрасахаридов.

Что касается большей части низкомолекулярных гепаринов, гепарин экстрагируют из слизи свиней и эти основные тетрасахариды представлены ниже. Они устойчивы к ферментативной деполимеризации и являются отражением последовательностей, имеющих сродство к антитромбину III. Их обозначают следующим образом: ΔIIa-IIs _glu и ΔIIa-IVs _glu (S.YAMADA, K.YOSHIDA, M.SUGIURA, K. SUGAHARA, K-H KHOO, H.R.MORRIS, A.DELL, J.Biol.Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993).

Последним компонентом смеси, расщепляемой гепариназами, является гликосериновое окончание ΔGLcA-Gal-Gal-Xyl-Ser (K.SUGAHARA, H.TSUDA, K.YOSHIDA, S.YAMADA, J.Biol.Chem.; 270(39), 22914-22923 (1995); K.SUGAHARA, S.YAMADA, K.YOSHIDA, P.de WAARD, J.F.G.VLIEGENTHART; J.Biol.Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992). Этот последний компонент почти не содержится в Lovenox (см. ЯМР в примере 5)

Другой аспект изобретения относится к способу хроматографии, используемому для определения групп 1,6-ангидро. Прежде всего речь идет о разделении разных полисахаридов, полученных в результате деполимеризации и обработки восстановителем, таким как NaBH₄.

Анионообменная хроматография (SAX) является методом разделения, наиболее подходящим для такой сложной смеси.

Можно использовать колонки длиной 25 см, наполненные стационарной фазой типа Spherisorb SAX, имеющей гранулометрию 5 мкм. Подходят любые диаметры традиционных колонок от 1 мм до 4,6 мм.

В качестве оборудования можно использовать хроматограф, обеспечивающий образование градиента элюирования с помощью УФ-детектора, предпочтительно снабженный диодной антенной для получения УФ-спектров компонентов и регистрации сложных сигналов, являющихся результатом разницы между коэффициентами поглощения двух волн разной длины, и обеспечивающий специфическое обнаружение ацетилированных олигосахаридов. Для осуществления такого вида обнаружения предпочтительными являются подвижные фазы, проницаемые для УФ до 200 нм. Это исключает использование традиционных подвижных фаз на основе NaCl, недостатком которых к тому же является необходимость в пассивированной хроматограмме с тем, чтобы сопротивляться коррозионному действию хлоридов. Используемая в данном случае подвижная фаза предпочтительно имеет в своей основе перхлорат натрия, но можно также использовать метансульфонатные или фосфатные соли.

рН, рекомендуемый для разделения, составляет от 2 до 6,5. Предпочтительным является рН, равный примерно 3. В данном случае его регулируют путем добавления соли, такой как фосфат, обладающей свойством буфера при рН 3, которое превосходит свойство перхлоратов.

В качестве примера ниже приведены стандартные условия осуществления хроматографического разделения:

Растворитель А: NaH₂PO₄ 2,5 мМ, рН доводят до 2,9 путем добавления H₃PO₄.

Растворитель В: NaClO₄ 1N-NaH₂PO₄ 2,5 мМ, рН доводят до 3,0 путем добавления H₃PO₄.

Градиент элюирования может быть следующим:

Т=0 мин: %В=3; Т=40 мин: %В=60; Т=60 мин: %В=80

Таким образом, изобретение относится к способу анализа, указанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что используют подвижную фазу, проницаемую для УФ до 200 нм.

Более конкретно изобретение касается подвижной фазы, указанной выше, на основе перхлората натрия, метансульфонатной или фосфатной солей.

Другой очень важный аспект изобретения заключается в способе детекции.

Способ был разработан с тем, чтобы повысить специфичность обнаружения УФ. Поскольку все неацетилированные полисахариды при заданном рН имеют довольно близкий УФ-спектр, можно селективно выявлять ацетилированные сахара, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при двух значениях длины волны, выбранных так, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.

В описанном ниже случае выбирают 202 нм и 230 нм в качестве значений длины волны для выявления и сравнения и регистрируют сигнал 202-230 нм. Выбор, конечно, зависит от рН подвижной фазы (регулирование в пределах нескольких нм может быть необходимо для оптимизации указанных условий). Датчиком, наиболее подходящим для такой технологии, является датчик DAD 1100 фирмы Agilent Technologies. В этом случае детекцию осуществляют двукратно, с одной стороны, при 234 нм, а, с другой стороны, при 202-230 нм. Принцип селективной детекции ацетилированных олигосахаридов показан ниже на фигуре, на которой УФ-спектр сульфатированного дисахарида Delta 1s сравнивают с УФ-спектром ацетилированного дисахарида Delta 1а

Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу анализа, описанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что способ детекции позволяет селективно выявлять ацетилированные сахара.

Еще более конкретно настоящее изобретение относится к способу анализа, описанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что селективную детекцию ацетилированных сахаров осуществляют, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при двух значениях длины волны, выбранных так, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.

Количественное определение четырех остатков 1,6-ангидро, описанных выше, требует достаточной селективности хроматографической системы в отношении всех других компонентов смеси. Оба дисахарида 1 и 2, обычно коэлюированные, имеют слабое разрешение по сравнению с ΔIIa, тем более, что последний присутствует в виде двух своих аномеров α и β.

Выявление двух дисахаридов 1 и 2 можно легко проверить, т.к. они образуются в течение нескольких часов при комнатной температуре в водном растворе ΔIIs, рН которого доводят до 13 путем добавления NaOH. Однако, если проводят двукратную детекцию, ацетилированные олигосахариды ΔIVa, ΔIIa, ΔIIIa, ΔIa, ΔIIa-IVs _glu и

ΔIIa-IIs _glu легко идентифицировать.

Причинами расщепления пиков являются, с одной стороны, аномерные формы и в меньшей степени эпимеризация глюкозамин ↔ маннозамин, частично затрагивающая ΔIIs, ΔIIIs и ΔIs, если они находятся на конце олигосахаридной цепочки.

Для количественного определения дисахаридов 1 и 2 образец низкомолекулярного гепарина, деполимеризованный гепариназами, восстанавливают под действием NaBH₄.

Преимущество такого восстановления заключается в том, что позволяет устранить аномерность α ↔ β путем раскрытия олигосахаридного концевого цикла. Полученная хроматограмма является более простой, т.к. аномерности аннулированы и восстановление ΔIIa снижает его удерживание на колонке и позволяет легко осуществить количественное определение дисахаридов 1 и 2.

Примеры хроматограмм, изображенные ниже на фиг. 1 и 2, иллюстрируют эти феномены и преимущества такого способа.

Наконец, изобретение относится также к новых сахаридным производным, полученным способом деполимеризации и восстановления, выбранным из дисахарида 1, дисахарида 2, дисахарида 3 и трисахарида 1.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение и не имеют ограничительного характера.

Пример 1

Ферментативную деполимеризацию проводят в течение 48 часов при комнатной температуре путем смешивания 50 мкл раствора 20 мг/мл низкомолекулярного гепарина, количество которого определяют, 200 мкл раствора 100 мМ уксусной кислоты/NaOH с рН, равным 7,0, содержащего 2 мМ ацетата кальция и 1 мг/мл BSA, с 50 мкл маточного раствора 3 гепариназ.

Восстановливают 60 мкл деполимеризованного гепариназами продукта путем добавления 10 мкл раствора NaBH₄ из расчета 30 г/л в ацетате натрия 100 мМ, приготовленного пред самым употреблением. Следует отметить, что гепариназы хранят при -30°С. Гепариназы находятся в буферном растворе и их титр составляет 0,5 UI/мл (состав буферного раствора: водный раствор рН 7 KH₂PO₄ c концентрацией 0,01 моль/л с добавлением сыворотки бычьего альбумина (BSA) из расчета 2 мг/мл).

Пример 2

ЯМР дисахарида 3, полученного описанным выше способом

Протоновый спектр в D₂O, 400 МГц, Т=298К, δ м.д.: 3,34 (1Н, дд, J=7 и 2 Гц, Н2), 3,72 (1Н, т, J=8 Гц, Н6), 3,90 (1Н, м, Н3), 4,03 (1Н, с, 4Н), 4,20 (1Н, д, J=8 Гц, Н6), 4,23 (1Н, т, J=5 Гц, Н3'), 4,58 (1Н, м, Н2'), 4,78 (1Н, м, Н5), 5,50 (1Н, с, Н1), 5,60 (1Н, дд, J= 6 и 1 Гц, Н1'), 6,03 (1Н, д, J=5 Гц, Н4').

Пример 3

ЯМР тетрасахарида 1, полученного описанным выше способом

Протоновый спектр в D₂O, 400 МГц, Т=298К, δ м.д.: 3,15 (1Н, с, Н2), 3,25 (1Н, м, Н2''), 3,60 (1Н, м, Н3''), 3,70-4,70 (14Н, массив, Н3/Н4/Н6, H2'/H3'/H4'/H5', H4''/H5''/H6'', H2'''/H3'''), 4,75 (1Н, м, Н5), 5,20-5,40 (2Н, м, H1' и H1''), 5,45 (1H, м, H1'''), 5,56 (1Н, м, Н1), 5,94 (1Н, д, J=5 Гц, Н4).

Пример 4

ЯМР тетрасахарида 1, полученного описанным выше способом

Протоновый спектр в D₂O, 600 МГц (δ м.д.): 3,28 (1Н, м), 3,61 (1Н, т, 7 Гц), 3,79 (1Н, т, 7 Гц), 3,95 (1Н, д, 6 Гц), 4,00 (1Н, с), 4,20 (1Н, м), 4,28 (2Н, м), 4,32 (1Н, д, 4 Гц), 4,41 (1Н, с), 4,58 (1Н, с), 4,61 (1Н, с), 4,90 (1Н, уш.с), 5,24 (1Н, с), 5,45 (1Н, с), 5,95 (1Н, с).

Пример 5

ЯМР ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser

Спектр в D₂O, 500 МГц (δ м.д.): 3,30 (1Н, т, 7Гц), 3,34 (1Н, т, 8 Гц), 3,55 (1Н, т, 7 Гц), 3,60 (1Н, т, 7 Гц), 3,63-3,85 (10Н, м), 3,91 (2Н, м), 3,96 (1Н, дд, 7 и 2 Гц), 4,02-4,10 (3Н, м), 4,12 (1Н, д, 2Гц), 4,18 (1Н, м), 4,40 (1Н, д, 6 Гц), 4,46 (1Н, д, 6 Гц), 4,61 (1Н, д, 6 Гц), 5,29 (1Н, д, 3Гц), 5,85 (1Н, д, 3 Гц).

Пример 6: Принцип количественного определения

В способе согласно изобретению в качестве широкой гипотезы допускают, что все ненасыщенные олигосахариды, содержащиеся в смеси, имеют одинаковый молярный коэффициент поглощения, равный 5500 моль^-1.1.см^-1.

Следовательно, можно определить весовой процент всех компонентов смеси, деполимеризированной в исходном низкомолекулярном гепарине. Для 4 производных 1,6-ангидро, которые соответствуют пикам 7, 8, 13 и 19, получают следующее весовое процентное содержание:

Area₇, Area₈, Area₁₃ и Area₁₉ соответствуют площадям каждого из пиков 7, 8, 13 и 19. Молекулярные массы каждого из этих 4 соединений составляют соответственно 443, 443, 545 и 1210.

∑ Mw_x.Area_x соответствует отношению площади каждого пика хроматограммы к молекулярной массе соответствующего продукта.

Если Mw обозначает среднюю массу рассматриваемого низкомолекулярного гепарина, процентное содержание олигосахаридных цепочек, заканчивающихся кольцом 1,6-ангидро, получают следующим образом:

Молекулярные массы компонентов следующие:

Олигосахариды Олигосахариды после восстановления Молекулярная масса 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19 1
20
3
21
22
23
7
8
24
25
26
27
13
28
29
30
31
32
19 741
401
734
461
461
503
443
443
503
563
563
563
545
605
1066
665
965
1168
1210

Номенклатура сахаридов и соответствие с пиками по фиг.1 и 2

IdoA:-α-L-идопиранозилуроновая кислота;

GlcA:-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота;

ΔGlcA: 4,5-ненасыщенная кислота: 4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая кислота

Gal: D-галактоза;

Xyl: ксилоза;

GlcNAc: 2-деокси-2-ацетамидо-α-D-глюкопираноза;

GlcNS: 2-деокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопираноза;

2S: 2-О сульфат

3S: 3-О сульфат

6S: 6-О сульфат

1: ΔGlcAβ_1-3 Galβ_1-3 Galβ_1-4 Xyl β_1-O-Ser

2: натриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

3: ΔGlcAβ_1-3 Galβ_1-3 Galβ_1-4 Xyl β_1-O-СН₂-СООН

4: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюкопираноза)кислоты

5: динатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

6: динатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

7: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β- D-глюкопираноза)кислоты (дисахарид 1)

8: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β- D-маннопираноза)кислоты (дисахарид 2)

9: динатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-β-D-глюкопиранозил)кислоты

10: тринатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-β-D-глюкопираноза)кислоты

11: тринатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

12: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

13: тринатриевая соль(4-деокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюкопираноза)кислоты (дисахарид 3)

14: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

15: пентанатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)

16: тетранатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты

17: гексанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3,6-ди-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)

18: гексанатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота)

19: гептанатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-маннопираноза)(тетрасахарид 1)

20: натриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюцит)кислоты

21: динатриевая соль(4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюцит)кислоты

22: динатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюцит)кислоты

23: динатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты

24: динатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюцит)кислоты

25: тринатриевая соль(4-деокси-α-L-трео-гексенгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-β-D-глюцит)кислоты

26: тринатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты

27: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюцит)кислоты

28: тринатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты

29: пентанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота -(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота (1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3-О-сульфо-α-D-глюцит) кислоты

30: тетранатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты

31: гексанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3,6-ди-О-сульфо-α-D-глюцит) кислоты

32: гексанатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота -(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота)(форма, восстановленная NaBH₄).

Фигура 1

Хроматографическое разделение Еноксапарина, деполимеризованного гепариназами до и после восстановления с помощью NaBH₄ (сигнал, обозначенный тонкой черной линией: УФ - 234 нм; сигнал, обозначенный жирной черной линией: УФ от 202 до 234 нм).

Фигура 2:

Хроматографическое разделение гепарина, деполимеризированного гепариназами, до и после восстановления с помощью NaBH₄ (сигнал, обозначенный тонкой черной линией: УФ - 234 нм; сигнал, обозначенный жирной черной линией: УФ от 202 до 234 нм).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу анализа гепаринов или низкомолекулярных гепаринов, и может быть использовано при контроле образцов, для обеспечения стандартизации способа Lovenox и получения однородной продукции. Способ количественного определения гепаринов или низкомолекулярных гепаринов осуществляют через следующие стадии: образец деполимезируют гепариназами, затем полученный деполимеризат восстанавливают, после чего проводят анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данное изобретение позволяет четко отличать Lovenox от других низкомолекулярных гепаринов, не содержащих производных "1,6-ангидро ". 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ количественного определения гепаринов или низкомолекулярных гепаринов в исследуемом образце для определения присутствия в нем олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
1) деполимеризация образца под действием гепариназ, которые находятся в виде смеси гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиазы II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.);
2) восстановление деполимеризата, причем в качестве восстановителя используют NaBH₄ или соль щелочного металла с анионом боргидрида;
3) количественное определение олигосахаридных остатков 1,6-ангидро путем ВЭЖХ,
причем используемый способ хроматографии представляет собой анионообменную хроматографию, при которой используют подвижную фазу, проницаемую для УФ до 200 нм, и при которой предпочтительно используют способ детекции, позволяющий селективно детектировать ацетилированные сахара, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при 2 значениях длины волны, выбранных таким образом, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемая подвижная фаза имеет в своей основе перхлорат натрия, метансульфонатные соли или фосфатные соли.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе реакции деполимеризации получают следующие олигосахаридные производные:

4. Дисахарид 1 формулы

5. Дисахарид 2 формулы

6. Дисахарид 3 формулы

7. Трисахарид формулы: