Способ получения 1,4 @ -дисахаридов,состоящих из звеньев структуры @ -Глюкозамина и гликуроновой кислоты Советский патент 1989 года по МПК C07H15/04 A61K31/7016 

IИзобретение относится к химии ди- сахаридов, a именно к способу получения новых дисахаридов, состоящих

КЗ звеньев структуры D-глюкозамина и гликуроновой кислоты общей формулы

где Z-NH, NHCOCHa, NHSOjM;

R - Cj- C.,,. алкил;

A - COOR,, COOM; низший алкил; М - щелочной металх., которые могут быть, использованы в качестве активного начала в лекар- ственных средствах, позволяюгцих регулировать некоторые стадии коагуля- ции крови

Целью изобретения является разработка доступного способа получения 1,4 в(-дисахаридов, состоящих из звеньев структуры D-глюкозамина и гли- куроновой кислоты.

Пример 1. Получение метил- (метил-2,3-ди-0-бенз1Ш-о -0-гликрпи- ранозид)уроната.

В 20 мл метиленхлорида вводят, 1:фи перемешивайии в течение ночи в темноте смесь 0,75 г (2 ммоль) метил 2,3-дигО-бензил-о(-1)-глюкопиранозида 20мг (0,08 ммоль) диметиламинпириди- на, 0,6 мл (4 ммоль) триэтиламина и 0,84 г (3 ммоль) тритилхпорида (трифенилметилхлорид).

Методом тонкослойной хроматогра- фии (метанол/хлороформ 0,2/20, объем/объем) установлено, что реакция полностью завершена.

К этой смеси последовательно добавляют 0,6 мл (4 ммоль; ТрИЭТИЛаМИ-

на, 0,35мл (3 ммоль) бензоилхлорида, 50 мг (0,20 ммоль) диметиламинпирид на и прЬдолжают перемевшвание еще в течение 2 сут.

Для удаления группы тритил к сме ей добавляют 0,5 М раствор п-толуол сульфокислоты в метаноле (20 мл). Через час смесь разбавляют метилен- хлоридом, затем промывают водой до нейтральной реакции. Продукт очища- ют методом колоночной хроматографии (40 г) с применением смеси эфир/ гексанЧЗ/1, объем/объем). Получаю чистую белую пену (0,84; 87,7%), которую немедленно окисляют.

Растворяют 480 мг (1 ммоль) продукта в 8 мл ацетона и добавляют при к охлаяденному,раствору при перемешивании раствор оксида

(VI) в 3,5 М серной кислоте (1,15 мл

аствора хрома содержит 1,17 г в

мл)..

Смеси дают нагреться до темперауры окружающей среды., затем через ч добавляют лед и воду и экстрагиуют продукт хлороформом. Хлороформую фазу промывают водой и высушенный астворитель выпаривают.

Полученную пену растворяют в метаноле (10 мг/мл) и добавляют едкий натр (5 мл ЗМ растнор.а).

Через 3 ч водную фазу промывают дважды эфиром, затем подкисляют соляной кислотой. После этого продукт экстрагируют эфиром. Органическую i фазу промьгаают водой, сушат и концентрируют.

Полученный таким образом раствор

етилируют диазометаном в эфире очищают на колонке с силикагелем (15 г) в смеси эфир/гексан (2,1, бъем/объем).

Выход 233 мг; 57,9;S.

Соединение кристаллизуют из смеси гексан/эфир и получают следующие характеристики: т. пл. Гс/ + 17,5 (с 1, хлороформ); ЯМР-спектр ТН (внутренний стандарт MeuSi); « ; 2,9 (d, 1Н, ОН); 3,35 (S, ЗН, ОСИ ; 3,69 (S, ЗН; СООСН,;; 7,27 (12Н; 2Ph).

найдено, %: С 65,53; Н 6,29.

Cl7H

Вычислено, %: С 65,65; Н 6,51.

П р и М е р 2, Получение дисаха- рида (3 - см, схемы на фиг. 1 и 2).

Синтез этого дисахарида (3) осуществляют исходя из моносахаридов (1) и (2) по следующей методике.- Реакцию проводят при в атмосфере азота и под защитой от света.

К раствору соединения (2) . (40 мг) в безводном дихлорметане (2 мл) постепенно добавляют соединение (и (98 мг), сим-коллидин (35мкл) и трифлат серебра (серебряная соль трифторметансульфокиспоты) (Ь6,5 мг). Через 1,5 ч реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (50 мл). Раствор фильтруют, промьгеают насыщенным раствором бикарбоната натрия (два раза по 20 мЛ), затем водой и в заключение высушивают.

Пблученный сироп после вьшарива- ния хроматографируют на силикагеле (15 г) в системе этилацетат/гексан (1/3, объем/объем).

Получают таким образом дисахарид (3) (60,2 мг; 74%).. ЯМР-спектр подтверждает требуемую структуру: наблюдаемые сигналы (внутренний стандарт MeuSi);«f; 1,95 (S, ЗН; -OCOCHj); 3,34 (S, ЗН, ОСНз); 3,68 (.S, ЗН, -СО-О-Шз); 5,53 (d, 1Н, 3,5 Гц, ); 7,20 - 7,40 (т, 20Н, 4Ph).

Пример 3. Получение дисахарида (6).

На первой стадии а) осуществляют омыление группы - ОАС в положении 6 звена D-глюкозамина, затем выполняют стадию в) сульфатирование группы - ОН в положении 6, и на стадии с) гидрирование - удаляют защитные группы Bz и одновременно переводят группу - N, в группу - NH7.

Получение дисахарида (4) омылением.

Растворяют соединение (3) в метаноле (10 мл), затем добавляют 1 н. раствор едкого натра (2 мл.). Через 3 ч раствор нейтрализуют пропусканием его через ионообменную смолу DOWEX 50W X 4 И (5 мл). После концентрирования остаток метилируют диазометаном с целью повторного введения метиловой группы, удаленной одновременно с ацетатом. Таким образом получают соединение (4).

Получение дисахарида (5) сульфа- тиронанием.

Соединение (4) растворяют в безводном диметилОюрмамиде (3 мл). Затем добавляют комплекс триметиламина /SOj (20 мг) и оставляют на ночь при 65°С. Потом смесь яыпаривают досуха, растворяют в хлороформе, разбавляют метанолом, затем пропускают через колонку со смолой DOWEX 50-Na Органическую фазу промывают водой, сушат, затем выпаривают хлороформ. Получают соединение (5) (40 мг).

Получение дисахарида (6) гидрированием.

Соединение (5) растворяют в метаноле (10 мл) и воде (1 мл). Добавляют 40 мг 5%-ного палладия на угле и подвергают действию водорода в течение 48 ч. После фильтрования и выпаривания получают соединение (6)

(29 мг).

П р и м е р 4. Получение дисахаридов (7) и (8).

Эти производные получают, подвергая дисахарид (6) реакции ацеТилиро- вания группы - ггН-г.звена глюкозами0

новой структуры глюкозамина с после- дующим омылением группы - СООМе звена структуры уроновой кислоты.

Соединение (6) (14 мг) растворяют в метаноле (3 мл). рН доводят до 8 при помощи 1 н. раствора едкого натра. Затем добавляют уксусный ангидрид (100 мкл). Через 30 мин вЫпа- ривают досуха. Остаток растворяют в воде (1,5 мл) и добавляют 1 н. раствор едкого натра (0,5 мл). После выдержки в течение ночи при температуре окружающей среды раствор ней- 5 трализуют соляной кислотой. Затем продукт обессоливают пропусканием через колонку Sephadex G - 25 (1,8 х X 20 см). Фракции, содержащие продукт, соединяют и хроматографируют на анионообменной смоле (AG 1 х 2 200-40U меш; слой 1 мл). Продукты элюируют с повьш1ением концентрации элюента хлорида натрия от О до ЗМ. После соединения фракций, содержащих- 5 соединение (8), последнее обессоливают путем пропускания через колонку Sephadex G - 25, примененную выше, : т 3,4 мг.

Строение соединения (8) подтверж- 0 дено определением содержания уроновой кислоты, глюкозамина и сульфатов, а также ЯМР-спектром, Его УФ-спектр показывает максимум абсорбции при

205 нм.

П р и м е р 5. Получение дисахаридов (9) и (10).

Для получения этих производных дисахарид (6) подвергают сначала реакции сульфатирования с целью пре- 40 вращения группы NH-i в группу , затем реакции омыления группы COOCHj, как указано выше.

35

Продукт (6) (14 мг) растворяют в воде (5 мл). рН доводят до 9,5 путем добавления 0,1 н. раствора едкого натра и поддерживают на этом уровне автоматически. Добавляют комплекс триметиламин/805 (20 мг). По прощест- ВИИ ночи еще добавляют комплекс (30 мг). Через 24 ч добавляют 1 н. раствор едкого натра (1 мл) и оставляют на 1 ч при температуре окружающей среды. После nP° y f««%;; f.5 катионообменяую смолу (DOWEX 50 WH ) и последующей нейтрализации едким натром соединение (Ю) очищают, как описано для соединения (8) (обессойива- ние, ионный обмен, обессоливаниеЬ

Таким образом получают 2,9 мг продукта (10).

Строение продукта (10) подтверждено определением содержания уроновой кислоты, глюкозамина и сульфатов, а также ЯМР-спектром.

Биологическая активность. Анти™ Ха-активность обнаружена у дисаха РИДОВ изобретения, тогда как другой тип дисахаридов, описанный Merchant и др., является негативным.

Дисахариды Активность п

Yin-Wess Ler Глюкозамин глгокуроновая структура по изобрете - -OS03 СОО- ,

ннв

в ацед ил или сульфат

R алканоил Глюкозамин-удурононая структура по, уровню техники:

СОО

СНгО$Оз О

OS03 migOa

Преимущества, связанные со структурой, В результате синтеза удалось получить соединение дисахарида, которое встречается в природных цепях гепарина, и это соединение имеет измеряемую биологическую активность. Этот результат нельзя было получить ввиду деполимеризации гепарина.

Деполимеризация вызывает изменение структурных групп цепей,, В случае, предусмотренном в работе Merchant и ДР« удуроновая группа сахарида имеет двойную связь.

Получение ггутем синтеза дисахарида, обладающего биологической активностью и соответствующего соединению, которое встречается в природе в гепарине, представляет значительный прогресс, используемый для получения более длинных цепей гепарина, чего не позволяет осуществлять известный уровень техни1си.

Субстрат для исследования ферментативной активности.

0

5

0

25

30

35

40

45

50

55

Использование указанных сахари- дов формул 8 и 10 по изобретению в качестве субстрата для сульфамида- зы, работая по методу Hopwood I. и Eliott Н. для детектирования синдрома Sanfilippo, типа А, дает результаты, которые можно сравнить с результатами, полученными с названными сахаридами, содержащими глюкозамин- N-сульфат, используемьй Hopwood и Eliott.

Дисахариды могут быть использованы в качестве субстрата для изучения ферментной активности, в частности, для проведения ферментативного расщепления.

Субстрат помещают в ферменты типа «/-глюкозаминидазы, гепаритиназы, гепариназы, N-десульфатазы и через определенные интервалы определяют степень разделения путем подачи продукта реакции в жидкостный хроматограф под большим давлением.

Таким образом можно исследовать распадение цепей уроновой кислоты- 1глюкозамина гликозаминогликанов типа 1гепарина.

Во-вторых, Дисахариды можно использовать в качестве эталонных продуктов.

Благодаря анТи-Ха-активности дисахаридов (подавление фактора Ха крови) их можно использовать при исследовании соотношения структуры с активностью путем сравнения с продуктами, полностью лишенными активности, или, 1наоборот, которые очень активны, типа мукополисахаридов или олигоса- харидов, полученных путем экстрагирования или химической или энзимати- ческой деполимеризации гепарина.

Преимуи;ества данных дисахаридов заключаются в следующем.

До изобретения не описан способ гликозилирования по положению 4 гликуронового звена, а также способ синтеза олигосахаридов., содержащих сахаридное звено, соединенное со звеном глюкуроновой кислоты.

Известны гексасахариды с 6 звеньями сахарозы, обладающие активностью в 2000 единиц lin-Wessler (такая активность служит указателем анти- тромбической активности).

Известны также октосахариды .8 звеньев; наряду с другими олигосаха- ридами, содержащими достаточно большое число звеньев сахарозы.

14701 6

Однако во всех перечисленных случаях речь пша о продуктах, полученных деполимеризацией гепарина или экстрагированием, а не путем синтеза.

Очевидно, что лишь путем синтеза моямо с уверенностью, воспроизводимостью и более высоким выходом получить продукт заданной структуры с необходимыми замещениями.|Q

Важно отметить, что деполимериза- ция гепарина сопровождается видоизменением звена в начале или в конце цепи олигосахарида.

При разложении гепарина фермента- 5 тивным путем в начале цепи образуется ненасьпценное уроновое звено, а при разложении химическим путем конечное глюкозаминовое звено преобразует в звено структуры 2,5-ангйдроманно. 20

Дисахариды, получаемые разложением под действием азотистой кислоты, т.е. указанные гексасахариды, не обладают антитромбической активностью и не могут использоваться в качестве эта- 25 лонных продуктов при исследованиях связи между структурой и активностью. А в силу видоизменения концевого звена они представляют значительно меньший интерес в сравнении с . ЗО дуктами по данному изобретению, обладающими неповрежденной структурой в отношении звеньев, образующих гепарин.

Олигосахариды также получали пу- j тем экстрагирования, т.е. не происходило видоизменения их звеньев, как при деполимеризации. Однако такие Олигосахариды содержат от 4 до 26

D-глюкозамина и гликуроновой кислоты, общей формулы .

0$ОзМ А

где Z - Ш, гаСОСНз, NHSOsM ;

А - COOR,, СООМ;

R - С ,-С4 алкил;

R,- низший алкил;.

М - щелочной металл, взаимодействием двух моносахаридов общей формулы

-ОАС COORi ОJ-0

t/ Г BzO |Х Ш

N3

где Ас - ацил;

Вт - бензил;

X - галоген;

R и Я, - имеют указанные значения, в присутствии в качестве катализатора соли серебра трифторметансуль- фокислоты и ацептора кислоты, такого как сим-коллидин, в среде органического растворителя, с последующей обработкой полученного дисахарида сильным основанием, а затем алкилирующим агентом с последующим сульфатирова- нием полученного дисахарида с помоxj-v « -.1г-.-- - : - -НИ СГ1 llUJl J ,. -

сахаридных звеньев и имеют активность Q комплекса триметиламин/ЗОэ, гидlin - Wesslera вьппе 100. В силу бо-

льшой активности такие продукты не

.могут быть эталонами, как продукты по данному изобретению, пригодные именно по причине их малой активноФ о р м у л а .изобретения

Способ получения 1,4V -дисахари- дов, состоящих из звеньев структуры

рированием с использованием в качестве катализатора палладия на угле, вы делением целевого продукта или обработкой его уксусным ангидридом в 45 слабоосновной среде и выделением полученного продукта или обработкой ег гидроокисью щелочного металла и комплексным соединением триметиламин/ V /80д.

10

D-глюкозамина и гликуроновой кислоты, общей формулы .

0$ОзМ А

де Z - Ш, гаСОСНз, NHSOsM ;

А - COOR,, СООМ;

R - С ,-С4 алкил;

R,- низший алкил;.

М - щелочной металл, взаимодействием двух моносахаридов общей формулы

-ОАС COORi ОJ-0

t/ Г BzO |Х Ш

N3

где Ас - ацил;

Вт - бензил;

X - галоген;

R и Я, - имеют указанные значения, в присутствии в качестве катализатора соли серебра трифторметансуль- фокислоты и ацептора кислоты, такого как сим-коллидин, в среде органического растворителя, с последующей обработкой полученного дисахарида сильным основанием, а затем алкилирующим агентом с последующим сульфатирова- нием полученного дисахарида с помоНИ СГ1 llUJl J ,. -

комплекса триметиламин/ЗОэ, комплекса триметиламин/ЗОэ, гид

рированием с использованием в качестве катализатора палладия на угле, выделением целевого продукта или обработкой его уксусным ангидридом в 45 слабоосновной среде и выделением полученного продукта или обработкой его гидроокисью щелочного металла и комплексным соединением триметиламин/ V /80д.

BnO t -o- oMe

lifsOBn

гО Оз-ка сооме

LO i, /-0

BnOn jOHe

1 3OBn

5)

rOSOjNa «Сооме

LO л 0 HO

ж /feY

л ГО

НО t -О- Л оме «.. / ) °«

зян

(6)

ososHtt сооме

И

о - Поме инАс он m

osoaNo cooNfl

М

Ш1АС,., ОН

(8)

СооМе

ю SO Сооме

io LO

®( f®l

ноп -0- поме 1га50зКа он

(,1 )§0зка cooNo

I

Л

г.2

HO L-o-J oMe NHS03Na он

(10)