СПОСОБ ОЦЕНКИ ФЕРТИЛЬНОСТИ МУЖЧИНЫ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к андрологии, сексологии.

Известна общепринятая методика анализа эякулята («Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью». 4-е изд., М., Медпроф, 2001. 144 с.). Она включает в себя: а) первоначальную макроскопическую оценку эякулята (разжижение, вид, объем, вязкость, определение рН); б) первый этап микроскопического исследования эякулята (предварительная оценка концентрации сперматозоидов, оценка подвижности сперматозоидов, клеточные элементы эякулята (кроме сперматозоидов); в) второй этап микроскопического исследования эякулята:

1. Окрашивание препарата для оценки жизнеспособности сперматозоидов

Под жизнеспособностью подразумевают долю (в процентах) «живых» сперматозоидов, которых определяют по исключению красителя или по гипоосмотическому набуханию. Жизнеспособность оценивают, если процент неподвижных сперматозоидов превышает 50%. Пропорцию живых и мертвых сперматозоидов определяют с помощью методов окрашивания препарата, основанных на принципе поглощения мертвыми клетками с поврежденными плазматическими мембранами определенных красителей. В световом или фазово-контрастном микроскопе производят подсчет 200 сперматозоидов, дифференцируя живые (неокрашенные) и мертвые (окрашенные) сперматозоиды.

Оценка жизнеспособности служит контролем точности оценки подвижности сперматозоидов, поскольку процент мертвых клеток не должен превышать (с учетом ошибки подсчета) процента неподвижных сперматозоидов. Наличие большого количества живых, но неподвижных сперматозоидов может указывать на структурные дефекты жгутиков.

2. Определение концентрации сперматозоидов

Концентрацию сперматозоидов определяют с помощью гемоцитометра в двух разных образцах одного эякулята, по одному на каждую сторону счетной камеры. Степень разведения определяют во время предварительной оценки концентрации сперматозоидов. Для разведения применяют раствор, приготовленный путем добавления в дистиллированную воду 50 г бикарбоната соды, 10 мл 35% раствора формалина и либо 0,25 г трипанового синего, либо 5 мл насыщенного водного раствора генцианвиолета. Конечный объем раствора доводят до 1 л. При работе с фазово-контрастным микроскопом краситель не добавляют.

Лейкоцитарные и автоматические пипетки, работа которых основана на принципе замещения воздуха, недостаточно точны, чтобы производить ими объемные разведения эякулята. Для этих целей надо использовать пипетки, работающие на принципе положительного замещения.

3. Оценка морфологии сперматозоидов

Приготавливают два мазка из образца свежего эякулята. На поверхность чистого, обезжиренного, сухого стекла наносят небольшую каплю эякулята, высушивают и фиксируют. Производят исследование морфологии эякулята. При морфологической оценке рассматривают функциональные участки сперматозоида, преобладающие дефекты (головки, шейки и средней части, хвоста).

Таким образом, данная методика дает характеристику спермограммы по разным параметрам. Однако этот подход не позволяет получить интегральный показатель, эквивалентный нормальному репродуктивному потенциалу мужчины. Показатели спермограмм по отдельности сопоставляются с процентными характеристиками нормы для каждого пациента.

Цель изобретения: повышение точности диагностики при мужском бесплодии.

Цель достигается путем оценки фертильности мужчин по интегральному показателю, который представляет собой абсолютное количество активно подвижных и морфологически сохранных сперматозоидов, которых не должно быть менее 5 млн/мл.

Определяют активно подвижные и морфологически сохранные сперматозоиды после их предварительной сепарации методом всплытия и центрифугирования в градиенте концентрации.

Способ осуществляют следующим способом.

А. Определение концентрации

1. Выделяют подвижные клетки сперматозоидов с помощью лабораторного препарата «Фертикалт Флашинг Медиум (далее ФФМ)», который производится согласно условиям Good Manufacturing Practice. ФФМ не содержит в себе гепарин. Для забора ооцитов добавляют гепарин или используется «Фертикалт Аспирэйшн Медиум». Так же как все культуральные среды, реагент ФФМ следует предварительно выдержать в инкубаторе в течение 24-х часов перед использованием. ФФМ стерилизован путем стерильной фильтрации. Он может храниться при температуре от 15°С до 25°С. Тестирован на культуре клеток.

Качество HSA (альбумин сыворотки человека) соответствует фармакопейным продуктам. Он полностью тестирован на антигены HbsAG, HIV 1/2, HCV.

2. Промывку сперматозоидов производят при комнатной температуре. Нативный образец центрифугируют в течение 15 мин при 300 g. Удаляют супернатант и оставляют около 0,5 мл непромытой спермы в пробирке. Добавляют 3 мл ФФМ. Медленно перемешивают до придания смеси однородного состояния. Центрифугируют 15 мин при 300 g.

3. Используют набор «Сил-Селект» фирмы ФертиПро (набор растворов с градиентом концентрации для подготовки спермы). Он предназначен для выделения из эякулята нормальных и подвижных сперматозоидов.

Помещают 2,5 мл Сил-Селект Плюс верхнего слоя в стерильную центрифужную пробирку. Используя 3 мл шприц с иглой, помещают 2,5 мл Сил-Селект Плюс нижнего слоя под верхний слой. Это достигают путем помещения кончика иглы на дно пробирки и медленного выдавливания из шприца нижнего слоя Сил-Селект Плюс.

Аккуратно помещают 2,5 мл жидкой спермы на верхний слой, используя микропипетку (шприц). Центрифугируют от 15 до 18 мин при 350-400 g. Удаляют супернатант до осадка. Используя шприц, добавляют 2-3 мл среды для промывки спермы (Флешинг Медиум) и ресуспендируют осадок. Центрифугируют 8-10 мин. при 300 g. Удаляют супернатант до осадка и помещают подвижные сперматозоиды в необходимый объем соответствующей среды.

Б. Определение морфологически сохранных сперматозоидов

Подсчитывают активно подвижные морфологически сохраненные сперматозоиды после их предварительной сепарации методом всплытия и центрифугирования в градиенте концентрации. Это позволяет получить показатель абсолютного числа гамет в 1 мл эякулята. Порогом фертильности является наличие гамет, способных к оплодотворению (подвижные и морфологически сохранные), в количестве не менее 5 млн/мл.

Снижение числа мужских гамет ниже этого порога требует проведения уточняющих диагностических мероприятий и лечебных воздействий, тогда как его превышение свидетельствует о том, что мужчина потенциально фертилен и не требует дальнейшего вовлечения в диагностический и лечебный процесс.

Интегральный показатель необходим для объективной оценки репродуктивного потенциала мужчины, позволяющий не только оценивать исходное качество мужских гамет, но и определить алгоритм восстановления фертильности в партнерской паре. По сравнению с прототипом в предлагаемом способе вместо множественных характеристик спермы, оценивающихся в относительных величинах, используют один абсолютный показатель - концентрация сперматозоидов с сохранными морфофункциональными характеристиками.

Пример 1. Нами обследовано 85 мужчин на базе Нижегородского областного клинико-диагностического центра по общепринятой методике и предлагаемым способом.

Установлено, что в тех случаях, когда количество функционально активных сперматозоидов составило 5,3±0,3 млн/мл (1 группа), беременность у половых партнерш фиксировалась во всех случаях наблюдения (56 мужчин - 65,88±5,14%). В тех случаях, когда количество функционально активных сперматозоидов составляло менее 5 млн/мл, беременность у половых партнерш не наступала (29 мужчин - 34,12±5,14%) (2 группа). При стандартном исследовании эякулята как в 1 группе, так и во 2 группе изменения касались подвижности, морфологии, жизнеспособности и не имели достоверных различий.

Пример 2. Пациент В., 34 лет из бесплодной супружеской пары. У него при анализе эякулята по общепринятой методике получены следующие данные: сперматозоидов - 50 млн/мл (10% - активных сперматозоидов; 10% - морфологически нормальных форм). Заключение: астенотератозооспермия. Пациент инферилен.

При оценке предлагаемым способом получены следующие данные: 10% от 50 млн (общее количество сперматозоидов) - 5 млн/мл подвижных активных сперматозоидов; 10% от 50 млн - 5 млн/мл морфологически сохранных сперматозоидов.

Заключение: Репродуктивный потенциал сохранен. Пациент фертилен. После дообследования супруги был установлен диагноз: эндокринное бесплодие (гипотиреоз), фармакологическая коррекция которого завершилась беременностью.

Таким образом, оценка эякулята по методу прототипа носила лишь ориентировочный характер, тогда как определение активно подвижных и морфологически сохранных сперматозоидов имело прогностический характер, что позволило эффективно проводить консервативную терапию по повышению фертильности мужчин.

Способ оценки фертильности мужчины   1 группа 2 группа   Количество мужчин % Количество мужчин % Снижение подвижности 11 19,64±5,31 7 24,14±8,08 Изменения морфологии 21 37,5±6,47 9 31,03±8,74 Снижение жизнеспособности 10 17,86±5,12 4 13,8±6,51 Сочетание двух и более факторов 14 25,0±5,79 9 31,03±8,74

Изобретение относится к области медицины, а именно к андрологии, и касается способа оценки фертильности мужчин. Способ заключается в изучении количества активно подвижных и морфологически сохранных сперматозоидов после их предварительной сепарации методом всплытия и центрифугирования в градиенте концентрации. Использование способа позволяет повысить точность диагностики при мужском бесплодии. 1 табл.

Способ оценки фертильности мужчины, включающий морфофункциональное исследование эякулята, отличающийся тем, что после предварительной сепарации методом всплытия или центрифугирования в градиенте концентрации эякулята определяют абсолютное количество активно подвижных и морфологически сохранных сперматозоидов и порогом фертильности считают показатель не менее 5 млн/мл.