СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) Российский патент 2018 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Известен «Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза», включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что антиген для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов инактивируют путем обработки бактериальной массы, полученной после выращивания бруцелл в количестве 50-60 млрд м.к. в 1 мл с 2%-ным детергентом вторичным алкилсульфатом натрия и сенсибилизируют формалинизированные эритроциты инактивированным антигеном из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов в течение 2 часов при 45°C (патент на изобретение №2415434, патентообладатель Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт, авторы Хаиров С.Г., Юсупов О.Ю., Рамазанова Д.М. и др.). Для получения данного антигена в процессе его изготовления к суспензии бруцелл, используемой для сенсибилизации 10%-ных формалинизированных эритроцитов, в качестве детергента добавляют выпускаемый Новочеркасским заводом синтетических продуктов поверхностно-активное моющее средство «Прогресс», действующим веществом которого является вторичный алкилсульфат натрия (ТУ 3810719-92; СТО 05807999-007-2006).

В связи с банкротством и закрытием Новочеркасского завода синтетических продуктов и отсутствием в продаже указанного детергента для его замены нами испытано множество поверхностно-активных веществ, в том числе препарат додецилсульфат натрия, моющие средства «Золушка», «Прогресс» (производитель ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московской обл.) и сильно концентрированное моющее средство «Прогресс» Московской фирмы «Селена». Обнадеживающие результаты получены при испытании универсального моющего средства «Прогресс» и препарата додецилсульфат натрия. Однако диагностикумы, изготовленные с применением указанных препаратов, не обладали достаточной активностью. Титры РНГА с диагностикумами, изготовленными с использованием данных препаратов при исследовании стандартного образца национальной агглютинирующей сыворотки, не превышали 1:800, тогда как в соответствии с нормативными документами (инструкция по изготовлению, ТУ) он должен быть не ниже 1:1600 с оценкой в четыре креста. Так как при серологическом исследовании в РНГА с применением диагностикума, обладающего недостаточно высокой активностью, часть животных, положительно реагирующих в РА и РСК, может остаться невыявленной, возникла необходимость в усовершенствовании способа получения диагностикума.

Целью изобретения является получение высокоактивного эритроцитарного диагностикума для РНГА, путем сочетанного применения в качестве детергентов новых поверхностно-активных препаратов.

Эта цель достигается тем, что для более полного извлечения из бруцелл антигенных комплексов, расширения их антигенного спектра и наиболее полного насыщения ими эритроцитов, следовательно, лучшей сенсибилизации эритроцитов и повышения активности диагностикума в РНГА, перед сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, суспензию бруцелл обрабатывают новым отечественным поверхностно-активным моющим средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа (г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000) в сочетании с препаратом додецилсульфат натрия (CH₃(CH₂)₁₁OS₃Na). Данное средство («Прогресс»), несмотря на одинаковое коммерческое название со средством «Прогресс», выпускавшимся Новочеркасским заводом синтетических продуктов и использовавшимся ранее по известному «Способу получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза» для производства антигена для РНГА (патент на изобретение №2415434) - совершенно другой препарат, что видно из нормативных документов на эти препараты - ТУ, ГОСТ и СТО. Препараты отличаются также по составу.

Сущность изобретения заключается в разработке способа получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов суспензией бруцелл, содержащей более широкий спектр антигенных комплексов, извлеченных из бруцелл путем автоклавирования их в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия, и воздействия композиции, состоящей из поверхностно-активного средства «Прогресс», основным действующим веществом которого является вторичный алкилсульфат натрия, в сочетании с додецилсульфатом натрия.

Преимущество изобретения заключается в том, что при сенсибилизации эритроцитов суспензией бруцелл, содержащей более широкий спектр антигенных комплексов, извлеченных из бруцелл, в присутствии смеси поверхностно-активных веществ достигается повышение активности диагностикума. Применение его для исследования сывороток крови животных на бруцеллез позволяет выявить более широкий спектр иммуноглобулинов, обладающих агглютинирующей и комплементсвязывающей активностью, т.е. установить бруцеллез у животных, реагирующих как в РА, так и РСК.

Пример

Культуру бруцелл штамма 19 В.abortus 19 трехсуточного роста смывают с поверхности питательной среды - мясопептонно-печеночно глюкозоглицеринового агара стерильным 12%-ным раствором хлорида натрия. Полученную суспензию доводят до концентрации 70-80 млрд м.к. в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности 12% раствором NaCl и для извлечения антигенного комплекса и обезвреживания бруцелл автоклавируют в течение 20-30 минут.

После установления стерильности, чистоты и типичности роста бруцелл штамма 19, бакмассу (взвесь бруцелл) подогревают до 45°C и в нее добавляют 4-4,5% препарата «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия. Смесь взвеси бруцелл с указанными детергентами в течение 45 минут выдерживают в водяной бане при температуре 45-50°C, периодически перемешивая через каждые 5-10 минут, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов проводят по способу Вайнбаха в модификации Прикаспийского зонального НИВИ, которая заключается в том, что формалинизацию эритроцитов проводят в течение 16-18 часов, вместо 24 часов, и встряхивают их в Шутель-аппарате не постоянно, как рекомендует автор, а через каждые 30 минут в течение 1,5-2 минут. Это дает возможность значительно сократить время стабилизации и получить максимальный выход эритроцитов без признаков гемолиза и склеивания, которые наблюдались иногда при постоянном встряхивании их в течение 24 часов. Сокращение времени формалинизации до 16-18 часов с периодическим встряхиванием способствовало также лучшей сохранности эритроцитов и их сорбционных свойств, а также увеличению срока хранения.

Подготовленные таким способом эритроциты сохраняют свою стабильность и адсорбционные свойства в течение двух лет и более при условии хранения при температуре 4-6°C.

Титрация бруцеллезного антигена для сенсибилизации эритроцитов

Для каждой серии формалинизированных эритроцитов определяют оптимальную дозу бруцеллезного антигена путем исследования в РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус. Предварительно антиген (взвесь бруцелл концентрации 70-80 млрд м.к. в 1 мл) подогревают до температуры 45-50°C, выдерживают в водяной бане при этой температуре в течение 45 минут при периодическом встряхивании, добавляют 4-4,5% нового поверхностно-активного моющего средства «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и 0,25% препарата додецилсульфат натрия. Сенсибилизацию эритроцитов проводят возрастающими дозами антигена в пробирках в присутствии указанных детергентов (4-4,5% препарата «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия) при температуре 45-50°C в течение 2 часов. Для титрации антигена к 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов, подогретых также до 45°C, добавляют по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 антигена с детергентами. Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают в водяной бане при 45-50°C в течение 2-х часов для сенсибилизации эритроцитов. Сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором от избытка антигена путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5-6 минут. После последнего центрифугирования в пробирки вносят по 4 мл физиологического раствора с целью получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов гомогенизируют путем встряхивания пробирок. Полученную взвесь эритроцитов 2,5%-ной концентрации используют в качестве диагностикума для постановки РНГА. Реакцию ставят со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400 и негативной сывороткой крови в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Сыворотки разводят физиологическим раствором. Все разведения сыворотки прогревают в водяной бане при 60-62°C в течение 30 минут. После чего к 0,5 мл каждого разведения сыворотки вносят по 0,05 мл (по одной капле) взвеси эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами антигена. Затем содержимое полистиролового планшета (разведения сыворотки + эритроцитарный антиген) тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 3-4 часа, после чего проводят учет реакции.

За оптимальную дозу антигена принимают ту, с которой в РНГА получена четкая положительная реакция со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведении 1:1600 с оценкой четыре креста.

Пример

Результаты проверки активности и специфичности 3-х эритроцитарных диагностикумов для РНГА, полученных путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов бруцеллезным антигеном (взвесью бруцелл), обработанным новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и препаратом додецилсульфатом натрия в отдельности и при сочетанном применении обоих препаратов даны в таблицах 1-3.

Из приведенных в таблицах 1 и 2 данных видно, что диагностикумы, изготовленные путем сенсибилизации эритроцитов бруцеллезными антигенами (взвесью бруцелл), обработанными новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и препаратом додецилсульфат натрия имеют недостаточную активность. При исследовании в РНГА стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус с применением эритроцитов, сенсибилизированных указанными препаратами (эритроцитарный диагностикум), титр реакции не превышал 1:800. Вместе с тем, результаты титрации антигена показали, что сенсибилизация эритроцитов взвесью бруцелл (антиген), обработанных смесью обоих препаратов, повышает активность сенсибилизированных эритроцитов и позволяет получить специфичный диагностикум, имеющий активность в РНГА со стандартным образцом сыворотки титр 1:1600 с оценкой в четыре креста (табл. 3). Одновременно установлено, что наиболее оптимальной для обработки бакмассы является 4-4,5%-ная концентрация поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% концентрация препарата додецилсульфата натрия. Наименьшей дозой антигена (сенситина), позволяющей получить эритроцитарный антиген с высокой активностью (титр 1:1600) и специфичностью при сочетанном применении детергентов, является 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

Изготовление опытной серии бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА

В автоклавированную бакмассу, имеющую концентрацию 70-80 млрд бруцелл в 1 мл добавляют 4,5% нового поверхностно-активного средства «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и 0,25% препарата додецилсульфат натрия, смесь подогревают до 45-50°C и выдерживают в водяной бане в течение 45 минут, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. С учетом результатов титрации для сенсибилизации эритроцитов антиген добавляют из расчета 2-2,5 мл на 1 мл 10% взвеси эритроцитов.

Для сенсибилизации эритроцитов смесь выдерживают при 45-50°C в водяной бане в течение 2-х часов при периодическом встряхивании через каждые 5-10 минут. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка антигена три раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10-15 минут. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор с таким расчетом, чтобы получить 5% взвесь эритроцитов, добавляют в качестве консерванта 0,25-0,3 формальдегида. Антиген проверяют на специфичность и активность в РНГА и хранят при 4-6°C.

Результаты проверки готового эритроцитарного диагностикума на активность и специфичность представлены в таблице 4.

Как видно из данных приведенных в таблице 4, сенсибилизация формалинизированных эритроцитов бруцеллезным антигеном, обработанным новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа в сочетании с 0,25% препарата додецилсульфат натрия, позволяет получить специфичный эритроцитарный диагностикум, имеющий титр РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус 1:1600 с оценкой четыре креста, то есть диагностикум, отвечающий по активности требованиям утвержденной нормативной документации (регламент по изготовлению, инструкция по применению и ТУ).

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Способ включает изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном. Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят суспензией бруцелл штамма В. abortus 19, полученной в концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл гипертонического 12%-ного раствора хлористого натрия. Добавляют 4-4,5% поверхностно активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия, смесь подогревают до 45-50°С и выдерживают 45 мин на водяной бане. После чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов из расчета 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов. Использование данного способа позволяет получитьспецифический диагностикум, имеющий активность РНГА со стандартным образцом сыворотки 1:1600, при совместном применении детергентов поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов. 4 табл., 1 пр.

Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при диагностике бруцеллеза, включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят суспензией бруцелл штамма В. abortus 19, полученной в концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл гипертонического 12%-ного раствора хлористого натрия, к которой добавляют 4-4,5% поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия, смесь подогревают до 45-50°С и выдерживают 45 мин на водяной бане, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов из расчета 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.