ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ГОЛУБЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/112 A61P31/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к области ветеринарной биотехнологии.

Целью изобретения является разработка и создание нового вакцинного препарата для профилактики сальмонеллеза голубей.

Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из ведущих мест. Летальность при этой инфекции может достигать 25-40%, а у молодняка - до 80-100% (Гусев, Вал. В. Сальмонеллезная инфекция у голубей / Вал. В. Гусев, Вик. В. Гусев. - Птицеводство, 2003. - №5. - С.48-53). Ущерб от сальмонеллеза также проявляется отставанием в росте и развитии переболевшей птицы, снижении оплодотворяемости голубок, недополучении приплода, ослаблении защитных сил организма голубей. Одновременно больные голуби и переболевшие голуби-бактерионосители являются возможным источником инфицирования животных и человека.

Исследованиями установлено, что серовариант Salmonella typhimurium (S. typhimurium), относящийся к серогруппе В, - является доминирующим возбудителем сальмонеллеза у голубей (94-98%). В 2-4% случаев первичные сальмонеллезы у голубей вызывает серовариант S. enteritidis.

Существующие способы профилактики сальмонеллеза голубей предусматривают проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий и ориентированы на широкое применение антимикробных препаратов (Бессарабов, Б.Ф. Болезни голубей. Монография /Бессарабов, Б.Ф. - М., 2004. - С.97-103; Шорохов, P.P. Меры борьбы и профилактики сальмонеллеза домашних голубей. / P.P.Шорохов, Е.В.Сусский, Г.А.Абарцумян. // Сб. статей ВГНКИ. - М., 2005. - Т.65. - С.135-140 и другие). Известные способы малоэффективны без активных средств специфической профилактики. Одним из основных способов защиты голубей от заболевания сальмонеллезом является вакцинопрофилактика. Для вакцинации необходимо применять высокоиммуногенную инактивированную вакцину.

Вакцинация живыми вакцинами из штаммов S. typhimurium приводит к дегенеративным изменениям в половом аппарате самок голубей, снижению оплодотворяющей способности и выводимости молодняка - голубят. Кроме того, живые вакцины обладают иммунодепрессивным действием, могут вызвать поствакцинальную болезнь, а циркуляция вакцинного штамма дает положительные результаты периодических контрольных исследований и ограничения на деятельность голубеводов.

Цель изобретения достигается созданием инактивированной вакцины против сальмонеллеза голубей. Технический результат заключается в снижении поствакцинальных осложнений, повышении сохранности птицы, высоком профилактическом эффекте в течение 12 месяцев при двукратном вакцинировании.

Для достижения цели и изготовления вакцины использовали штаммы S. typhimurium М-5в t-ДЕП, S. typhimurium Д-1в t-ДЕП, S. enteritidis 25 Яв е-ДЕП, обладающие способностью индуцировать в организме привитых птиц высокую степень напряженности иммунитета. Штаммы получены выделением из трупов голубей с последующей селекцией в 2003-2004 гг., депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов в качестве производственных (справки о депонировании 2744/19 от 01.11.2007, 2741/19 от 01.11.2007, 2743/19 от 01.11.2007 соответственно).

Штаммы обладали следующими свойствами: Salmonella typhimurium М-5в t-ДЕП и Salmonella typhimurium Д-1в t-ДЕП - грамотрицательные подвижные палочки, вызывающие при росте равномерное помутнение мясо-пептонного бульона (МПБ), на мясо-пептонном агаре (МПА) растущие в «S» форме (гладкие ограниченные колонии диаметром 2-5 мм), на агаре Эндо - прозрачные с фиолетовым оттенком, на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском. Ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, манит, мальтозу, сорбит, арабинозу, рамнозу, дульцит, не ферментируют сахарозу, лактозу, растут на среде Симонса, образуют сероводород, не образуют индол, оксидазоотрицательны, каталазоположительны. Агглютинируются монорецепторными сальмонеллезными сыворотками O4, H-i; 1,2. Патогенны для белых мышей, голубей, морских свинок. LD₅₀ для белых мышей массой 14-16 г при подкожном инфицировании составила для штамма Salmonella typhimurium М-5в t-ДЕП - 647 микробных клеток (мкр. кл.), для штамма Salmonella typhimurium Д-1в t-ДЕП - 5495 мкр. кл.

S. enteritidis 25 Яв е-ДЕП - грамотрицательные подвижные палочки, вызывающие равномерное помутнение при росте на МПБ, растущие в «S» форме (гладкие ограниченные колонии диаметром 2-5 мм) на МПА, на агаре Эндо - прозрачные с фиолетовым оттенком, на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, манит, мальтозу, сорбит, арабинозу, рамнозу, дульцит, растет на среде Симонса, образует сероводород, не образует индол, оксидазоотрицательны, каталазоположительны. Не ферментируют сахарозу и лактозу. Агглютинируются монорецепторными сыворотками O9, Н-1 m,g. Патогенны для белых мышей, голубей, морских свинок и цыплят. LD₅₀ для белых мышей массой 14-16 г при подкожном инфицировании составила 14125 мкр. кл.

Препарат готовили, высевая лиофильно высушенные штаммы в пробирки с бульоном Хоттингера (с питательностью 120 мг% аминного азота). После восстановления свойств и проверки штаммов на отсутствие диссоциации проводили пересев во флаконы с той же средой. Через 18 часов инкубирования при 37°С расплодку пересевали в реакторы или бутыли в объеме не менее 10% от количества среды. В процессе культивирования и перед инактивацией проводили отбор проб для проверки чистоты роста сальмонелл.

Чистые бульонные культуры инактивировали формалином в объеме 0,3% к общему объему в течение 21-22 дней. Осаждение проводили полиэтиленгликолем в течение 72 часов. Надосадочную жидкость удаляли, осадочную массу ресуспендировали в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации каждого штамма 6 млрд. мкр. кл. в 1 см³. Итоговая концентрация каждого штамма, используемого в изготовлении вакцины, - 2 млрд. мкр. кл. в 1 см³ препарата.

Готовую вакцину проверяли на стерильность, чистоту, безвредность, иммуногенность.

Стерильность определяли последовательными посевами из вакцины на питательные среды: МПБ, МПА, Китта-Тароцци, Сабуро. Проверку на чистоту осуществляли изучением мазков с вакциной, окрашенных по Граму. Безвредность изучали путем внутривенного и внутримышечного введения вакцины в 2-кратной дозе с последующим 10-дневным наблюдением, убоем птицы и изучением места введения при вскрытии.

Пример конкретного применения

Вакцину инактивированную полиэтиленгликолевую против сальмонеллеза голубей инъецировали внутримышечно в грудную мышцу в дозе 0,5 см³. Вакцинацию проводили с 25-30-дневного возраста дважды с интервалом 35-40 дней.

Пример 1 применения препарата

Лабораторное испытание вакцины инактивированной полиэтилен-гликолевой против сальмонеллеза голубей (контроль иммуногенности) проводили на 20 голубях, беспородных, массой 250-280 г.Для этого были созданы две группы (по 10 голубей) 25-30-дневного возраста: опытная и контрольная, которых кормили и содержали по принципу аналогов. Голубей опытной группы прививали вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см³, голубям контрольной группы вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия в той же дозе.

Через 21 день проводили инфицирование голубей обеих групп внутримышечно штаммом S. typhimurium М-2ф t-ДЕП (производственно контрольный) в дозе 5 млн. мкр. кл. Инфицирующую дозу определяли, используя оптический стандарт мутности энтеробактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Наблюдение вели 14 дней, учитывали заболевших, павших, проводили бактериологический анализ из патологического материала от трупов (печень, селезенка, кровь из сердца, красный костный мозг).

Сохранность в опытной группе составила 90% при 80%-ной летальности в контроле. Клинические признаки заболевания характеризовались потерей аппетита, одышкой, угнетением, взъерошенностью оперения, диареей. От всех трупов (8 голубей контрольной группы и 1 голубя опытной группы) при бактериологическом исследовании патологического материала: окраска мазков-отпечатков по Граму, культивирование на МПА, МПБ, агаре Эндо, висмут-сульфитном агаре, определение ферментативных свойств на средах Гисса, реакция агглютинации - выделена S. typhimurium во всех пробах.

Т.о. вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей обладает высокой иммуногенностью.

Пример 2 применения препарата

Определение эффективности вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей в полевых условиях проводили на частной голубятне г.Москвы в сентбяре 2006 года. Общее поголовье голубей составляло 160 птиц, в том числе молодняка до года - 104 головы. В течение предшествующего исследованию года у птиц периодически отмечали случаи болезни со следующими клиническими признаками: отказ от корма, угнетение различной степени, расстройство дефекации с появлением зеленой окраски фекалий, истощение. У взрослых голубей болезнь носила хронический характер, проявляясь поражением суставов ног и крыльев и, как следствие, - адинамией и неспособностью к полету, периодическими расстройствами работы желудочно-кишечного тракта. У молодняка в возрасте до 3-4 месяцев болезнь проявлялась быстро наступающим угнетением, отказом от корма, нервными явлениями. В результате проведенных бактериологических иследований трупов павших голубей, а также патологического материала, полученного при вскрытии внутрисуставных абсцессов больных птиц, поставлен диагноз - сальмонеллез.

Для оздоровления данной голубятни в сентябре 2006 года проводили наряду с комплексом ветеринарно-санитарных мероприятий вакцинацию птицы вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей двукратно с интервалом 40 дней в дозе 0,5 см³. В качестве контроля на ферме было оставлено 20 взрослых голубей без вакцинации, имевших до лечения поражения, характерные для сальмонеллеза. После лечения антибиотиками они были помечены и оставлены в общем помещении с основным вакцинированным поголовьем. В течение срока наблюдения среди контрольных птиц периодически наблюдали признаки заболевания в виде угнетения, отказа от корма, появления артритов и т.д. При проведении бактериологического исследования фекалий и содержимого внутрисуставных абсцессов от заболевших голубей выделяли S. typhimurium - всего от 6 птиц. При этом два голубя были вынужденно убиты. При бактериологическом исследовании из печени, селезенки, красного костного мозга выделена S. typhimurium от обоих голубей.

Остальных клинически здоровых голубей с 25-дневного возраста вакцинировали. Больных и подозрительных в заболевании голубей лечили антибиотиками, предварительно подтитрованными к выделеному от птиц изоляту S. typhimurium, в течение 10 дней. Всего вакцинировано 140 птиц.

В результате проведенной работы на ферме в течение 9 месяцев наблюдения среди птиц родительского стада не было выявлено голубей с поражением суставов и другими признаками, характерными для сальмонеллеза. Кроме того, необходимо отметить, что период наблюдения приходился на сезон размножения птиц. Полученные от предварительно вакцинированных родителей голубята, были привиты тем же препаратом в дозе 0,5 см³ в возрасте 25-30 дней. Случаев заболевания сальмонеллезом среди привитого молодняка голубей также не было выявлено.

Из представленных данных видно, что проведенная вакцинация голубей вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой позволила обеспечить 100% сохранность птицы родительского стада и молодняка в неблагополучной по сальмонеллезу голубятне.

Применение вакцины позволит повысить сохранность птицы, предотвращая заболеваемость голубей сальмонеллезом. Кроме того, вакцинация голубей будет способствовать нераспространению опасного зооантропоноза - сальмонеллеза среди птиц, животных и человека.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В качестве антигенов вакцина содержит инактивированные 0,3%-ным формалином и осажденные полиэтиленгликолем высокоиммуногенные штаммы Salmonella typhimurium М-5в t -ДЕП, Salmonella typhimurium Д-1в t-ДЕП и Salmonella enteritidis 25 Яв е-ДЕП с итоговой концентрацией каждого - 2 млрд. мкр. кл. в

1 см³ препарата. Вакцину вводят внутримышечно в толщу грудной мышцы в дозе 0,5 см³ с 25-30-дневного возраста дважды с интервалом 35-40 дней. Группа изобретений позволяет снизить поствакцинальные осложнения, повысить сохранность птицы и профилактировать ее заражение в течение 12 месяцев при двукратном введении вакцины, 2 н.п. ф-лы.

1. Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей, включающая антигены сальмонелл, отличающаяся тем, что содержит в качестве антигенов инактивированные 0,3%-ным формалином и осажденные полиэтигленгликолем высокоиммуногенные штаммы Salmonella typhimurium М-5в t-ДЕП, Salmonella typhimurium Д-1в t-ДЕП и Salmonella enteritidis 25 Яв е-ДЕП с итоговой концентрацией каждого 2 млрд. мкр. кл. в 1 см³ препарата.

2. Способ применения вакцины инактивированной против сальмонеллеза голубей по п.1, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно в толщу грудной мышцы в дозе 0,5 см³ с 25-30-дневного возраста дважды с интервалом 35-40 дней.