УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИММУННОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ГРИППА ТИПА B Российский патент 2009 года по МПК C07K16/10 

Область техники

Данное изобретение относится к моноклональному антителу к вирусу типа В гриппа и устройству для иммунологического анализа с использованием антитела.

Уровень техники

С древних времен грипп является наиболее широко распространяющимся во всем мире, периодически повторяющимся заболеванием. Каждый раз при широком распространении инфекции некоторое количество людей умирает от этого заболевания. В 1931 году вирус, вызывающий заболевание, был выявлен, что открыло дорогу к выяснению причин заболевания. Вирус, вызывающий грипп, классифицируют на три типа, а именно на типы А, В и С, в зависимости от антигенности растворимого нуклеопротеина (NP), локализованного в вирусе. Вирус А гриппа далее разделяют на подтипы в зависимости от антигенности двух оболочечных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA).

С 1972 года для профилактики гриппа использовали вакцину, инактивированную формалином, после ее обработки эфиром. В последние годы помимо вакцины, используемой для профилактики гриппа, были разработаны лекарства против гриппа, которые в настоящее время широко используются. Такие терапевтические лекарства включают в себя гидрохлорид амантадина, эффективный против вируса А гриппа, и занамивир (zanamivir) и фосфат осельтамивира (oseltamivir phosphate), эффективные против вирусов А и В гриппа.

При выборе таких терапевтических лекарств важно обнаружить вирус гриппа в образце, подтвердить, что он является причиной инфекции, и определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или типа В. Далее, в связи с тем что вирус А гриппа является более заразным, чем вирус В гриппа, и вызывает возникновение серьезных симптомов, определение типа инфекционного вируса является особенно важным для ранней терапии.

Вирусы гриппа обычно определяли (детектировали), используя антитела к вирусу гриппа. Что касается антител к вирусу А гриппа, известны антитела для определения подтипа вируса, специфично распознающие НА или NA вируса, необходимые для производства вакцины после определения подтипа вируса, который, как ожидается, будет превалировать (см., например, ссылки на патентные источники 1 и 2).

В качестве устройства для детектирования вируса гриппа известно устройство проточного типа (см. ссылку на патентные источники 3), которое содержит твердую фазу, на которой может быть иммобилизован антиген вируса гриппа. В этом устройстве вирус гриппа, содержащийся в образце, взаимодействует с твердой фазой, затем антитело к вирусу А гриппа, меченное первым ферментом, и антитело к вирусу В гриппа, меченное вторым ферментом, взаимодействуют с твердой фазой. После этого добавляют субстраты для проведения реакции и визуально наблюдают окрашивание твердой фазы. Несмотря на то что в этом устройстве используют антитела к нуклеопротеинам вирусов гриппа, чувствительность измерений является низкой, а процедура измерений является сложной, так что это устройство не является простым измерительным средством. Кроме того, известно устройство для иммунологического анализа (которое далее будет названо «иммунохроматографическим устройством»), в котором использовано моноклональное антитело к нуклеопротеину вируса гриппа (см. ссылку 1 на непатентную литературу).

С другой стороны, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором использована сходная с лентой основа (матрикс), через которую может быть осуществлен перенос жидкости (далее это устройство будет названо «иммунохроматографическим устройством»). С помощью этого устройства можно легко и за короткое время измерить антитело или антиген в образце просто посредством нанесения образца на заранее определенную область без специального устройства или сложной измерительной техники. Например, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором множество антигенов Treponema pallidum (TP антигены) связаны в зоне детектирования, и множество антител к TP, содержащихся в образце, можно определить в отдельных зонах детектирования (см. ссылку на патентные источники 4). Это устройство содержит множество зон детектирования, в которых соответственно связаны различные TP антигены. При помощи этого устройства различные антитела к TP определяют раздельно. Это позволяет определить время инфицирования, что используют при выборе терапевтического лекарства и пр.

Ссылки на патентные источники.

1. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №6-100594.

2. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №7-304799.

3. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №2001-124775.

4. Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №9-229938.

Ссылки на непатентную литературу.

1. The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 2001; 75:792-799.

Раскрытие изобретения

Проблемы, на решение которых направлено данное изобретение

Большинство традиционных моноклональных антител к вирусу В гриппа, распознающих поверхностный антиген НА или NA, обладают низкой реакционной способностью и специфичностью, так что они не могут быть признаны удовлетворительными для высокочувствительных иммунологических анализов. Кроме того, несмотря на то что в устройствах проточного типа используют антитела к нуклеопротеину вируса гриппа, процедуры измерений являются сложными, так что устройства также не являются простыми, и частота ошибочных положительных результатов при определении (детектировании) вируса В гриппа является высокой (см. J. Clin. Microbiol; 40:1675-1680, 2002).

С другой стороны, для выбора терапевтического лекарства требуется устройство, с помощью которого можно отличить вирус типа А гриппа от вируса типа В гриппа за одну операцию в течение короткого промежутка времени, без использования специального диагностического оборудования или измерительного устройства, причем в таком устройстве должно быть использовано антитело, которое взаимодействует с вирусами типа В гриппа, включая мутировавшие штаммы вируса гриппа, но при этом не взаимодействует с вирусом типа А гриппа.

Следовательно, целью данного изобретения является получение антитела к вирусу типа В гриппа, обладающего высокой специфичностью. Другой целью данного изобретения является разработка устройства для иммунологического анализа, с помощью которого можно было бы специфично определить вирус типа В гриппа.

Способы решения проблем

Авторы данного изобретения интенсивно изучали и преуспели в создании антитела к вирусу типа В гриппа, соответственно к нуклеопротеину вируса В гриппа, которое специфично взаимодействует с вирусом В гриппа, что и является целью данного изобретения. Авторами данного изобретения также было сделано заключение, что можно разработать устройство для иммунологического анализа, с помощью которого можно определить вирус В гриппа, при этом отличая его от вируса А гриппа, за счет использования этого антитела к вирусу В гриппа.

Таким образом, в данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу типа В гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, имеющим молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа, и которое практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу В гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса В гриппа, в которой антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом по данному изобретению.

Результат изобретения.

В данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу В гриппа, которое иммунологически взаимодействует с вирусом В гриппа, но не взаимодействует с вирусом А гриппа. С помощью иммунологических анализов с использованием моноклонального антитела к вирусу В гриппа по данному изобретению можно определить (детектировать) или количественно измерить вирус В гриппа, при этом отличая его от вируса А гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором используют описанное выше моноклональное антитело к вирусу В гриппа по данному изобретению. С помощью устройства для иммунологического анализа по данному изобретению вирус В гриппа можно легко детектировать, при этом отличая его от вируса А гриппа. Следовательно, ожидается, что данное изобретение внесет значительный вклад в диагностику и терапию гриппа.

Краткое описание чертежей.

На Фиг.1 приведены результаты экспериментов, в которых моноклональные антитела по данному изобретению взаимодействуют с антигенами, фракционированными методом белкового блоттинга.

На Фиг.2 приведено схематичное изображение в поперечном сечении варианта выполнения измерительного устройства по данному изобретению.

На Фиг.3 приведен вид сверху, показывающий пример состояния (режима работы), когда измерительное устройство по данному изобретению помещено в кассету.

На Фиг.4 приведено поперечное сечение, выполненное по линии А-А', показанной на Фиг.3.

Наилучший вариант выполнения изобретения.

Как было описано выше, моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, причем нуклеопротеин имеет молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа. Тот факт, что антитело вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, имеющим молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа, может быть подтвержден методом белкового блоттинга, включающим гель-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с использованием вируса В гриппа в качестве образца. Согласно данным белкового блоттинга (см. Примеры ниже), моноклональное антитело по данному изобретению распознает нуклеопротеин, имеющий молекулярную массу от 60 кДа до 75 кДа.

Как уже было отмечено выше, моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело» в данном описании означает, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело на таком уровне, чтобы ее можно было детектировать, и даже если антитело вступает в реакцию антиген-антитело, то степень взаимодействия оказывается очевидно меньше, чем степень взаимодействия с вирусом В гриппа, так что специалистам в данной области ясно, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом А гриппа» означает, что антитело практически не вступает в реакцию антиген-антитело не только с нуклеопротеином вируса А гриппа, но также и с белками или другими компонентами вируса А гриппа. В предпочтительном варианте выполнения моноклональное антитело по данному изобретению также практически не взаимодействует с вирусом С гриппа.

Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса В гриппа. На поверхности частицы вируса В гриппа расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N), причем вирус В гриппа разделяют на подтипы в зависимости от различий в структурах Н и N. Моноклональное антитело по данному изобретению предпочтительно вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеинами, по крайней мере, тех подтипов вируса В гриппа, которые описаны далее в Примерах (см. Таблицу 3), и более предпочтительно с нуклеопротеинами всех известных подтипов вируса В гриппа.

Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с патогенами других инфекционных заболеваний, симптомы которых хотя бы частично сходны с симптомами гриппа. Таким образом, предпочтительное моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело, например, с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы 1-3), RS (респираторно-синцитиальным) вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы 1-3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae.

Хорошо известно, что с помощью расщепления антитела папаином или пепсином можно получить фрагменты антитела, обладающие способностью связываться с соответствующим антигеном, такие как Fab фрагмент и F(ab')₂ фрагмент (которые в данном описании названы «антигенсвязывающими фрагментами»). Согласно данному изобретению антигенсвязывающие фрагменты моноклонального антитела по данному изобретению можно использовать таким же образом, как и моноклональное антитело по данному изобретению, что находится в рамках данного изобретения.

Моноклональное антитело по данному изобретению можно получить традиционным гибридомным способом, используя нуклеопротеин вируса В гриппа в качестве иммуногена. В связи с тем, что в качестве иммуногена используют нуклеопротеин вируса В гриппа, может быть использована любая вирусная культуральная среда, вакцина против НА гриппа, НА антиген для HI и рекомбинантный антиген до тех пор, пока нуклеопротеин присутствует в большом количестве и может служить в качестве иммуногена. Для того чтобы ингибировать высокоиммуногенные НА и NA, присутствующие в антигене, нуклеопротеин очищают с помощью ультрацентрифугирования (см., например, J. Biochem.; 102:1241-1249, 1987) или можно использовать антиген, обработанный протеазой (см., например, J. Immunol. Methods; 180:107-116, 1995).

Моноклональное антитело можно получить с помощью гибридомы, полученной иммунизацией животного антигеном, содержащим описанный выше нуклеопротеин вируса В гриппа, и слиянием животной клетки, продуцирующей моноклональное антитело, с опухолевой клеткой.

Описанная выше гибридома может быть получена следующим способом. Нуклеопротеин вируса В гриппа, полученный как описано выше, который предполагают использовать в качестве антигена, внутрибрюшинно или внутривенно вводят животному, такому как мышь, дробно, несколько раз с промежутками от 2 до 3 недель вместе с полным адъювантом Фрейнда (Freund's complete adjuvant). Затем осуществляют слияние клеток селезенки или аналогичных клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми клетками, которые могут расти in vitro, такими как линия клеток миеломы.

Слияние можно осуществить, используя полиэтиленгликоль согласно традиционному способу Коhlеr и Milstein (Nature, Vol.256, 495, 1975) или используя вирус Sendai или сходный вирус.

Отбор гибридом, продуцирующих антитело, которое распознает нуклеопротеин вируса В гриппа, из полученных слиянием клеток можно провести следующим образом. Те из полученных слиянием клеток, которые остаются живыми в HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) среде и/или НТ (гипоксантин, тимидин) среде, могут быть отобраны в качестве гибридом способом ограниченного разбавления. Затем гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, которое специфично распознает нуклеопротеин вируса В гриппа, можно отобрать с помощью EIA (иммуноферментного анализа) или сходным способом, причем культуральная среда гибридомы взаимодействует с высокоочищенным нуклеопротеином вируса В гриппа, иммобилизованным на аналитической плашке, а затем дополнительно взаимодействует с антимышиным иммуноглобулином (Ig) или аналогичным.

В приведенных ниже Примерах описано множество полученных предпочтительных моноклональных антител по данному изобретению, и три из них были названы соответственно гибридома FrB1-03, гибридома FrB1-07 и гибридома FVB2-16. Эти гибридомы были депонированы в Международном Патентном Депозитарии Организмов (International Patent Organism Depositary), Национальном Институте Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Япония), в качестве международного депонирования в соответствии с Будапештским Соглашением. Таким образом, гибридома FrB1-03 была депонирована под идентификационным названием «FrB1-03» под инвентарным номером FERM ВР-10070 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19441); гибридома FrBl-07 была депонирована под идентификационным названием «FrB1-07» под инвентарным номером FERM ВР-10071 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19442); и гибридома FVB2-16 была депонирована под идентификационным названием «FVB2-16» под инвентарным номером FERM BP-10069 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19440).

Каждую из описанных выше гибридом можно выделить путем культурирования гибридомы в среде, обычно используемой для клеточных культур, а моноклональное антитело можно выделить из супернатанта культуры. В альтернативном варианте моноклональное антитело можно выделить путем введения гибридомы животному того вида, от которого она была получена, для аккумулирования в нем асцита и путем выделения моноклонального антитела из асцита.

Для выделения моноклонального антитела можно использовать традиционные способы очистки. Примеры таких способов очистки включают в себя гельпроникающую хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с использованием белка А и аналогичные способы.

Было подтверждено, что моноклональные антитела, полученные описанным выше способом, взаимодействуют с нуклеопротеином вируса В гриппа и с различными штаммами вируса В гриппа. Они вступают в реакцию с существующими в настоящее время доступными штаммами (см. Таблицу 3 ниже) вируса В гриппа, и исходные штаммы можно определить, используя моноклональные антитела по данному изобретению. С другой стороны, была протестирована перекрестная реактивность с микроорганизмами, например аденовирусом (типы 1-7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans. Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. Взаимодействие не было обнаружено.

Моноклональное антитело согласно данному изобретению можно использовать в иммунологических анализах для определения (детектирования) или количественного измерения вируса В гриппа. Иммунологические анализы сами по себе хорошо известны, и можно использовать любой из известных способов иммунологических исследований. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по типу реакции, их можно разделить на сэндвичевые иммунологические анализы, конкурентные иммунологические анализы, иммунологические анализы, основанные на агглютинации, белковый блоттинг и пр. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по использованной метке, их можно разделить на флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноферментные анализы, радиоиммунологические исследования, иммунологические анализы, основанные на использовании биотина, и пр. Можно использовать любой из этих способов. Более того, диагноз можно получить с помощью иммуногистоокрашивания. В тех случаях, когда в иммунологическом исследовании используют меченое антитело, можно использовать любой из хорошо известных способов, т.к. сами по себе способы мечения антител хорошо известны. Известно, что расщепление антитела с помощью папаина или пепсина приводит к получению фрагмента антитела, такого как Fab фрагмент или F(аb')₂ фрагмент, обладающего способностью связываться с соответствующим антигеном (такой фрагмент в данном описании назван «антигенсвязывающим фрагментом»). Антигенсвязывающие фрагменты антитела по данному изобретению также могут быть использованы таким же образом, как и само антитело по данному изобретению.

Такие иммунологические исследования сами по себе хорошо известны из уровня техники, поэтому нет необходимости разъяснять их в данном описании. Если коротко, в сэндвичевых иммунологических анализах, например, антитело по данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на твердом носителе (подложке) как первое антитело. Первое антитело затем вступает в реакцию с образцом, а после промывания твердого носителя получившийся в результате комплекс взаимодействует со вторым антителом, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа по данному изобретению. После промывания твердого носителя измеряют второе антитело, связанное с твердым носителем. Если пометить второе антитело ферментом, флуоресцентным соединением, радиоактивным соединением, биотином и т.д., то измерить количество второго антитела, связанного с твердым носителем, можно, измеряя количество метки. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых содержит известную концентрацию нуклеопротеина, после чего для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренного количества метки от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, наложив измеренное количество на калибровочную кривую. Следует заметить, что описанные выше первое антитело и второе антитело можно поменять. В иммунологических анализах, основанных на агглютинации, антитело согласно данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на частицах, таких как латексные частицы, и частицы взаимодействуют с образцом, после чего проводят измерение оптической плотности. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых имеет известную концентрацию нуклеопротеина, и для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренной оптической плотности от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, сравнив измеренную оптическую плотность с калибровочной кривой.

В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором использовано моноклональное антитело согласно данному изобретению, с помощью которого вирус В гриппа можно легко определить, при этом отличая его от вируса А гриппа.

Устройство для иммунологического анализа содержит зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу В гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса В гриппа, в которой антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом по данному изобретению. Образец, нанесенный в зоне нанесения образца, вступает в реакцию антиген-антитело с меченым антителом, находящимся в зоне меченого реагента, за счет чего формируется меченый комплекс антиген-антитело. Этот комплекс антиген-антитело быстро переносится проявителем, поступающим из зоны подачи проявителя, в зону детектирования вируса В гриппа. В данном случае антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на матриксе и меченый комплекс антиген-антитело вступает в реакцию антиген-антитело, так что меченый комплекс антиген-антитело оказывается иммобилизованным на матриксе. Иммобилизован ли комплекс антиген-антитело в зоне детектирования вируса В гриппа или нет, оценивают по наличию метки. Проявитель, проходящий через зону детектирования вируса В гриппа, абсорбируется в зоне поглощения (впитывания) проявителя. Зона нанесения образца и зона меченого реагента могут быть одной и той же зоной (в этом случае образец наносят на зону меченого реагента). В устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению, по крайней мере, одно из следующих- меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса В гриппа - является моноклональным антителом по данному изобретению. Одно из антител может быть также поликлональным антителом. Так как множество молекул нуклеопротеина вируса В гриппа обычно связываются или соединяются друг с другом, вирус В гриппа можно определить, даже если меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса В гриппа, являются тем же самым моноклональным антителом.

Составные части (компоненты) устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению ниже будут описаны по отдельности.

Матрикс

Матрикс в виде ленты в устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению изготовлен из водопоглощающего материала, в котором жидкость может перемещаться за счет капиллярных сил. Примеры водопоглощающих материалов включают в себя целлюлозу и ее производные, такие как целлюлоза и нитроцеллюлоза, и фильтровальную бумагу, изготовленную из одного стекловолокна или включающую стекловолокно, мембраны и пористые материалы. Несмотря на то что размер матрикса не ограничен, предпочтительными являются матриксы в форме полоски (ленты) с шириной примерно от 3 мм до 10 мм и длиной примерно от 30 мм до 100 мм, так как они удобны в обращении. Для предотвращения неспецифичной адсорбции белков, присутствующих в образце, на матриксе в процессе измерения, часть или весь матрикс можно блокировать сывороточным животным белком, таким, как бычий сывороточный альбумин (BSA (БСА)), казеином, сахарозой и др.

Зона детектирования

В зоне детектирования можно задать участок детектирования вируса В гриппа, на котором на матриксе иммобилизовано антитело к вирусу В гриппа. По крайней мере, одно из следующих - антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на этом участке детектирования, и меченое антитело к вирусу В гриппа, описанное ниже - является моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению, причем предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению. Антитело к вирусу В гриппа в зоне детектирования предпочтительно размещено на матриксе в форме линии, перпендикулярной направлению перемещения потока жидкости (продольному направлению матрикса) для измерения с высокой чувствительностью. Подходящее поликлональное антитело, используемое в качестве поликлонального антитела к вирусу В гриппа, может быть выбрано из коммерчески и легко доступных поликлональных антител.

Антитело к вирусу В гриппа в зоне детектирования представляет собой описанное выше антитело, причем моноклональные антитела могут быть использованы индивидуально или в комбинации. Антитело к вирусу В гриппа может быть антителом к IgG или IgM или может быть Fab, F(ab')₂ или аналогичным, являющимся антигенсвязывающим фрагментом этих антител.

Антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на участке детектирования, может быть физически адсорбировано непосредственно в зоне детектирования матрикса или может быть зафиксировано с помощью химической связи, например ковалентной. В альтернативном варианте антитело к вирусу В гриппа может быть связано с нерастворимым в воде носителем, а носитель может содержаться в матриксе. Примеры нерастворимых носителей включают частицы, полученные путем осаждения смеси желатина, аравийской камеди и гексаметафосфата натрия (Японская патентная публикация №63-29223), полистирольные латексные частицы, стекловолокно и пр. Моноклональное антитело к вирусу В гриппа может быть связано с нерастворимым носителем за счет описанного выше химического связывания или физической адсорбции.

В зоне детектирования, помимо участка детектирования вируса В гриппа с помощью антитела к вирусу В гриппа, может быть задан участок детектирования вируса А гриппа с помощью антитела к вирусу А гриппа. Такой участок детектирования вируса А гриппа может быть расположен вблизи от участка детектирования вируса В гриппа либо до («выше»), либо после («ниже») участка детектирования вируса В гриппа по направлению потока проявителя. Антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на участке детектирования вируса А гриппа, может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и может, как и в случае антитела к вирусу В гриппа, быть иммобилизовано на матриксе за счет химической связи или физической адсорбции.

Как было отмечено ранее, предпочтительно задать участок детектирования вируса А гриппа в дополнение к участку детектирования вируса В гриппа, для того чтобы одновременно определять (измерять) вирус В гриппа и вирус А гриппа. Такие участки детектирования расположены после зоны меченного ферментом реагента, зоны нанесения образца и зоны подачи проявителя, и до зоны поглощения проявителя, по направлению потока жидкости в матриксе. Участки детектирования могут быть заданы на матриксе в форме множества линий, каждая из которых имеет ширину от примерно 0.5 мм до 5 мм, причем эти линии расположены близко друг к другу. В случае использования матрикса с шириной около 5 мм, участки детектирования можно задать посредством нанесения антитела и антигена, обычно в количестве примерно от 0.1 мкг до 10 мкг соответственно, и высушивания матрикса.

Зона меченого реагента

Зону меченого реагента можно сформировать путем нанесения меченого антитела к вирусу В гриппа на зону, заданную на матриксе, таким образом, чтобы меченое антитело сохраняло свою подвижность. Эта зона может быть сформирована до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя из зоны подачи проявителя. Эта зона может быть сформирована путем нанесения меченного ферментом реагента на матрикс или посредством ламинирования водопоглощающей подложки, содержащей меченный ферментом реагент, или путем включения меченного ферментом реагента в часть или весь матрикс, который плотно контактирует с подложкой. В качестве водопоглощающей подложки может быть использована подложка, которую используют для зоны нанесения образца (описана ниже).

По крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению, и предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу В гриппа по данному изобретению. Помимо меченого антитела к вирусу В гриппа могут быть использованы его фрагменты, как и в случае описанного выше антитела в зоне детектирования.

Меченое антитело к вирусу В гриппа можно получить путем связывания антитела с меткой. Примеры меток включают ферменты, коллоидные металлические частицы, окрашенные латексные частицы, люминесцентные соединения, флуоресцентные соединения и пр. В качестве фермента могут быть использованы различные ферменты, применяемые в иммунологических исследованиях (иммуноферментных анализах, EIA). Примеры ферментов включают щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-D-галактозидазу и др. Примеры коллоидных металлических частиц включают коллоидное золото, коллоидный селен и др.

Метку и антитело к вирусу В гриппа можно соединить известными способами, используя ковалентную или нековалентную связь. Примеры способов связывания включают глутаральдегидный метод, периодатный метод, малеимидный метод, пиридилдисульфидный метод, а также способы, в которых используют различные сшивающие агенты (см., например, "PROTEIN, NUCLEIC АСID AND ENZYME" («Белок, нуклеиновая кислота и фермент»). Extra Edition (дополнительный выпуск), т.31, стр.37-45 (1985)). В способах, в которых применяют сшивающий агент, могут быть использованы, например, N-сукцинимидил-4-малеимид-масляная кислота (GMBS), N-сукцинимидил-6-малеимид-гексановая кислота, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновая кислота или другие аналогичные соединения. В способах, в которых применяют ковалентное связывание, могут быть использованы функциональные группы антитела. В альтернативном варианте меченое антитело к вирусу В гриппа можно получить описанными выше способами связывания после введения функциональной группы, такой как тиольная группа, амино группа, карбоксильная группа, гидроксильная группа и др. В способах, основанных на нековалентном связывании, может быть использована физическая адсорбция и др.

В тех случаях, когда вирус А гриппа определяют одновременно с детектированием вируса В гриппа, как было указано выше, меченое антитело к вирусу А гриппа вводят в зону меченого реагента для подготовки устройства. Меченое антитело к вирусу А гриппа и меченое антитело к вирусу В гриппа, содержащиеся в зоне меченого реагента, могут находиться либо в матриксе, либо в водопоглощающей подложке, либо они могут содержаться и в матриксе, и в водопоглощающей подложке. В случае одновременного определения вирусов А гриппа и В гриппа, в связи с тем, что используют большие количества меченых реагентов, для измерений с высокой чувствительностью меченные ферментом реагенты индивидуально или в комбинации полезно вводить и в матрикс, и в подложку. Несмотря на то что количество меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от ожидаемого количества изучаемого вещества в образце, обычно оно составляет от примерно 0.01 мкг до 5 мкг в расчете на сухой вес. При введении меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа в зону меченного ферментом реагента, их можно использовать вместе со стабилизатором, агентом, регулирующим солюбилизацию, и пр.

Зона нанесения образца

Зону нанесения образца можно задать на матриксе после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя, без введения реагента или сходного вещества. Зону нанесения образца также можно задать в: 1) заранее заданной области (месте) после зоны подачи проявителя и до зоны меченного ферментом реагента по направлению потока проявителя, 2) заранее заданной области (месте) после зоны меченого реагента и до зоны детектирования по направлению потока проявителя, или 3) заранее заданном участке зоны меченого реагента. В устройстве, в котором зону нанесения образца формируют в зоне меченного ферментом реагента, предпочтительно вводить водопоглощающую подложку, содержащую ферментную метку для эффективного проведения исследования, как было указано выше. С помощью устройства, содержащего подложку, можно с высокой чувствительностью измерить неосновной (примесный) компонент, содержащийся в образце, так как можно нанести большое количество образца жидкости. Материал, из которого изготовлена водопоглощающая подложка, выбирают из материалов, которые плохо адсорбируют меченый реагент и вирус гриппа. Примеры материалов включают в себя пористые материалы, изготовленные из синтетических или природных полимерных соединений, таких как поливиниловый спирт (PVA), нетканые материалы, целлюлозу и пр., причем эти материалы можно использовать индивидуально или в комбинации. Несмотря на то что размер, толщина, плотность и прочие аналогичные характеристики подложки не ограничены, для эффективного проведения исследования предпочтительно использовать подложку, имеющую продольную и поперечную длину примерно от 3 мм до 10 мм и толщину примерно от 0.5 мм до 4 мм.

Зона подачи проявителя

Зона подачи проявителя представляет собой зону, в которую подается проявитель, сформированную на одном конце матрикса в его продольном направлении. Исследование можно начать путем погружения этой зоны в проявитель, содержащийся в емкости в количестве, достаточном для того, чтобы проявитель достиг зоны поглощения проявителя. Емкость для жидкости, содержащую проявитель, можно присоединить к зоне подачи проявителя, и исследование может быть начато посредством открывания заглушки (крышки, перегородки) сосуда с жидкостью, за счет чего проявитель вступает в контакт с матриксом. Проявитель может содержать подходящее поверхностно-активное вещество, буферный агент, стабилизатор, антибактериальный агент и пр. В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, в проявитель можно добавить субстрат в дополнение к описанной далее зоне субстрата. Примеры буферных растворов, содержащих буферный агент, включают ацетатный буфер, боратный буфер, трис-НСl буфер, буфер на основе диэтаноламина и т.д. В зоне подачи проявителя можно установить подложку для проявителя для его стабильной и непрерывной подачи в матрикс. В качестве подложки для проявителя можно использовать фильтровальную бумагу, изготовленную, например, из целлюлозы или производных целлюлозы.

Зона поглощения проявителя

Зону поглощения (впитывания) проявителя задают на конце матрикса, противоположном тому концу, на котором расположена зона подачи проявителя. Эту зону создают для поглощения (впитывания) подаваемого в матрикс проявителя, с тем чтобы без труда осуществить проведение анализа. Зону поглощения проявителя можно задать за счет удлинения матрикса. Для ускорения поглощения к матриксу можно присоединить водопоглощающий материал. В качестве водопоглощающего материала можно использовать фильтровальную бумагу, обладающую высокой емкостью по отношению к воде, изготовленную из природных полимерных соединений, синтетических полимерных соединений и пр. Можно использовать губку или аналогичное приспособление. Несмотря на то что зона поглощения проявителя изготовлена из абсорбционного материала в форме подложки, объем которой позволяет впитать весь проявитель, компактное устройство для иммунологического анализа можно изготовить посредством ламинирования поглощающего материала, расположенного над или под матриксом.

Зона субстрата

В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, находящийся в зоне меченого реагента, субстрат может содержаться в проявителе, как было описано выше, или зону субстрата можно задать на матриксе вблизи зоны подачи проявителя. Зона субстрата предпочтительно может быть образована в описанной выше подложке для проявителя, расположенной в зоне подачи проявителя, за счет введения субстрата в подложку для проявителя.

В качестве субстрата в зависимости от фермента, используемого в качестве метки, могут применять различные субстраты, дающие окрашивание, флуоресцентные субстраты, люминесцентные субстраты и пр.

(а) Субстраты, дающие окрашивание

Для пероксидазы: 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (ABTS), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) и диаминобензидин (DAB), совместно с пероксидом водорода;

Для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).

(б) Флуоресцентные субстраты.

Для щелочной фосфатазы: 4-метилумбеллиферилфосфат (4MUP).

Для β-D-галактозидазы: 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид (4MUG).

(в) Люминесцентные субстраты.

Для щелочной фосфатазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-фосфорилокси)-фенил-1,2-диоксетан-2-натриевая соль (AMPPD).

Для β-D-галактозидазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-β-D-галактопиранозил)-фенил-1,2-диоксетан (AMGPD).

Для пероксидазы: люминол и изолюминол совместно с пероксидом водорода.

В тех случаях, когда задают зону субстрата, ее обычно можно сформировать посредством нанесения водного раствора субстрата в форме линии на подложку для проявителя и высушивания раствора. При желании можно добавить агент, усиливающий сигнал, стабилизатор, агент, контролирующий солюбилизацию, и пр. Положение зоны субстрата не ограничено в пределах подложки для проявителя, расположенной на конце матрикса. Количество субстрата, добавляемого в проявитель или подложку для проявителя, можно выбрать в зависимости от условий проведения анализа. Обычно оно составляет от примерно 5 мкг до 500 мкг на устройство.

Расположение зон

Предпочтительный вариант выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению схематично показан на Фиг.2-4. На Фиг.2 цифрой 2 обозначен матрикс, цифра 4 обозначает зону меченого реагента, цифра 8 обозначает зону нанесения образца, цифра 3 обозначает зону подачи проявителя, цифра 5 - зону поглощения проявителя, цифрой 6а обозначена зона детектирования вируса А гриппа, цифра 7 обозначает зону субстрата, и цифра 9 обозначает образец. В этом варианте выполнения изобретения зона 8 нанесения образца и зона 4 меченого реагента представляют собой одну зону. Цифрой 6b обозначена зона детектирования вируса В гриппа, цифрой 10 обозначена зона контроля (подтверждения прохождения проявителя), и цифрой 11 обозначена емкость для проявителя (см. Пример 4 ниже).

Способ использования устройства для иммунологического анализа.

С помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению можно определять (исследовать) вирус В гриппа в различных образцах. Анализы можно проводить, если сначала нанести образец в зону нанесения образца устройства для иммунологического анализа, а затем подать проявитель в подложку для проявителя, за счет чего образец будет перемещаться по матриксу. В качестве разбавителя для образца можно использовать буфер, содержащий поверхностно-активное вещество. Проявитель перемещается по матриксу за счет капиллярных сил и достигает зоны поглощения проявителя. В зоне поглощения проявителя абсорбируются те компоненты образца, которые не связались в зоне детектирования, меченный ферментом реагент и пр., и проявление (перемещение) заканчивается. Через заранее заданное время (обычно от 10 до 20 минут) исследуют зону детектирования и измеряют количество метки, связавшейся с участком детектирования за счет вируса В гриппа, содержащегося в образце, что позволяет определить (измерить) вирус В гриппа. В зависимости от использованных субстрата или субстрата и фермента детектирование можно провести с помощью визуального наблюдения или с помощью измерительного устройства, такого как колориметр, флуориметр, счетчик фотонов, фоточувствительная пленка и др. Простым способом измерения является, например, способ, согласно которому окрашивание зоны детектирования определяют визуально. Согласно этому способу, используя цветовую шкалу, соответствующую концентрациям вируса В гриппа, можно провести полуколичественный анализ. Можно провести количественный анализ, если окрашивание зоны детектирования перевести в цифровую форму с помощью колориметра или другого аналогичного устройства.

Далее принцип исследования будет объяснен более подробно на примере предпочтительного варианта выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, показанного на Фиг.2-4 в качестве примера. Образец 9 наносят на зону 8 нанесения образца, и проявитель из емкости 11 для проявителя подают в зону 3 подачи проявителя. Проявитель перемещается по матриксу 2 в направлении, показанном горизонтальной незаштрихованной стрелкой, за счет капиллярного воздействия. Субстрат, содержащийся в зоне 7 субстрата, растворяется в проявителе и продвигается вместе с ним. С другой стороны, образец 9 вступает в реакцию с меченым антителом в зоне 4 меченого реагента, так что образуется меченый комплекс антиген-антитело. Когда проявитель доходит до этого участка, меченый комплекс антиген-антитело начинает перемещение в матриксе 2, реагируя при этом с субстратом, содержащимся в проявителе. Когда меченый комплекс антиген-антитело достигает зоны 6b детектирования вируса В гриппа, он взаимодействует с антителом к вирусу В гриппа, иммобилизованным в этой зоне, за счет чего иммобилизуется. В тех случаях, когда вирус В гриппа содержится в образце, появляется окрашивание за счет реакции между меченым ферментом и субстратом. Напротив, когда вирус В гриппа в образце отсутствует, меченое антитело не может вступить в реакцию антиген-антитело и, таким образом, не может быть иммобилизовано в зоне 6b детектирования вируса В гриппа, и окрашивание не возникает. Таким образом, содержит ли образец вирус В гриппа или нет, можно определить по тому, окрашена ли зона 6b детектирования вируса В гриппа или нет. В зоне 10 контроля иммобилизован фермент, который дает окрашивание при реакции с реагентом в проявителе. Поэтому, если зона 10 контроля окрашена, это означает, что проявитель дошел до этой зоны. В альтернативном варианте в зоне 10 контроля может быть иммобилизовано антитело к ферментной метке, посредством чего меченый реагент, который доходит до зоны 10 контроля, захватывается этим антителом, и захваченная метка и субстрат, содержащийся в проявителе, взаимодействуют таким образом, что возникает окрашивание, когда туда доходит проявитель (в приведенных далее Примерах иммобилизовано антитело к щелочной фосфатазе). Одновременно можно также провести детектирование вируса А гриппа, вводя меченое антитело к вирусу А гриппа в зону 4 меченого реагента и задав зону 6а детектирования вируса А гриппа, так что в процессе одного анализа можно определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или вирусом типа В.

Матрикс можно ламинировать и закрепить на подложке, изготовленной из пластика, металла, бумаги и др. Посредством фиксации матрикса, в том случае если он изготовлен из пластика или аналогичного материала, использования емкости, содержащей проявитель, в зоне подачи проявителя, и применения покрытия матрикса в виде корпуса («чехла»), содержащего сквозные отверстия, соответствующие описанным выше зонам, можно создать удобное в обращении устройство. Образец, который должен быть проанализирован с помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, представляет собой образец, полученный от человека, животного и пр., который предположительно содержит вирус гриппа. Примеры образцов включают в себя экстракты жидкостей тела, таких как мазок из носа, аспират из носа, мазок из зева и пр.

Данное изобретение ниже будет описано более подробно с помощью Сравнительных Примеров и Примеров. Однако изобретение не ограничено приведенными примерами.

Примеры

Пример 1. Получение моноклонального антитела к вирусу В гриппа

Вакцину против НА гриппа (штамм B/Yamanashi/166/98), или рекомбинантный нуклеопротеин вируса В гриппа (r-NP/B из B/Yamanashi/166/98); база данных DDBJ/GenBank database), использовали в качестве иммуногена.

После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON) иммуноген вводили Balb/c мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген вводили посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей и клеток миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA (ТИФА)), в котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа, содержащая нуклеопротеин антигена, и рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В гриппа (r-NP/B). Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (товарный знак) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и выдерживали полученную смесь для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.

Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантные нуклеопротеины (r-NP/H1N1 из штамма A/New Caledonia/20/99 и I-NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93; база данных DDBJ/GenBank). В результате получили три штамма гибридом (гибридома FrB1-03, гибридома FrB1-07 и гибридома FVB2-16), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа. Все подклассы всех моноклональных антител, полученных от этих трех 3 гибридом, принадлежали к IgG1. Реакционная способность гибридом приведена в Таблице 1.

Таблица 1
Реакционная способность моноклональных антител. Моноклональное антитело Антиген r-NP/B вакцина r-NP/H1N1 r-NP/H3N2 FrB1-03 1.682 0.578 0.020 0.022 FrB1-07 1.721 0.596 0.024 0.023 FVB2-16 1.404 0.431 0.019 0.016

Пример 2. Реакционная способность моноклональных антител согласно белковому блоттингу.

Реакционная способность моноклональных антител была подтверждена с помощью белкового блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов, вакцины против НА гриппа (содержащей нуклеопротеин антигена) и раствора вируса. Каждый образец растворили в 0.01 М трис-НСl буфере (рН 8.0), содержащем 0.001 М ЭДТА, 1% SDS, 5% 2МЕ (2-меркаптоэтанол), 10% глицерина и 0.005% ВРВ (бромфеноловый голубой). Каждый из полученных растворов нагрели до 100°С, после чего исследовали с помощью электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили стандартным способом, используя e-PAGEL, концентрация геля 10% (производства АТТО). После электрофореза полосы перенесли на PVDF мембрану (производства АТТО) и блокировали с помощью Block Асе (производства DAINIPPON PHARMACEUTICAL) при 4°С в течение ночи. После удаления блокирующего раствора и после промывания мембраны PBS-Tween добавили раствор каждого моноклонального антитела, доведенный до концентрации 10 мкг/мл и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween добавили меченные ферментом антитела к мышиному IgG (производства CAPPEL), разбавленные в 4000 раз реакционной средой, и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween мембрану экспонировали на рентгеновскую пленку (производства KODAK) в течение от 1 до 15 минут, используя для детектирования сигналов систему детектирования для белкового блоттинга ECL Western Blotting Detection System (производства AMERSHAM BIOSCIENCES).

Моноклональные антитела FrB1-03 и FrB1-07 дали полосу в районе примерно от 60 кДа до 75 кДа. Результаты приведены на Фиг.1.

Пример 3. Измерение антигена с помощью ELISA с использованием моноклонального антитела.

Раствор каждого из трех типов очищенных моноклональных антител в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.5, имеющий концентрацию 2 мкг/мл, добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, чтобы иммобилизовать антитело. Затем каждую лунку промыли PBS, содержащим 0.1% Твин 20 (Tween 20, товарный знак) (PBS-Tween), туда же добавили по 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и проводили блокирование при 4°С в течение ночи. Раствор вируса В гриппа, растворенного в реакционной среде, добавили в каждую лунку в количестве 100 мкл на лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в них добавили каждое из меченных щелочной фосфатазой моноклональных антител, растворенных в реакционной среде, в количестве 100 мкл/лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и добавили в каждую лунку по 100 мкл 4-нитрофенилфосфата (4-NPP). После реакции при комнатной температуре в течение 30 минут добавили стоп-раствор в количестве 100 мкл/лунку. Измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм. Те образцы, для которых уровень окрашивания превосходил контрольный (на буфере) не менее чем в 2.1 раза, считали положительными, и реакционную способность выражали в терминах окончательного разведения, при котором образец все еще считался положительным.

Все из 9 комбинаций, полученных с тремя типами моноклональных антител, обладали реакционной способностью, в 4 и более раз превосходящей реакционную способность коммерческих моноклональных антител к вирусу В гриппа. Результаты приведены в Таблице 2.

Таблица 2
ELISA для измерения антигенов. Моноклональное антитело АНТИГЕН Антитело, меченое ферментом Иммобилизованное антитело B/Yamanashi/166/98 B/Mie/1/93 FrB1-03 FrB1-03 х40 х80 FrB1-07 х20 х80 FVB2-16 х40 х80 FrB1-07 FrB1-03 х40 х80 FrB1-07 х40 х80 FVB2-16 х40 х160 FVB2-16* FrB1-03 х80 х320 FrB1-07 х80 х320 FVB2-16 х80 х160 Коммерческое антитело** Коммерческое антитело** х20 х80 * Fаb'-меченое
** Коммерчески доступное моноклональное антитело

Сравнительный Пример 1. Получение моноклонального антитела к вирусу В гриппа, меченного щелочной фосфатазой.

Моноклональное антитело к вирусу В гриппа (FrB1-03) обработали пепсином для удаления Fc участка, с тем чтобы получить F(аb')₂, дисульфидную связь расщепили 2МЕ (2-меркаптоэтанолом производства NACALAI TESQUE) для получения F(ab')₂ с открытой тиольной группой. Затем щелочную фосфатазу, в которую была введена малеимидная группа, соединили с F(ab')₂, полученный продукт очистили с помощью гель-проникающей хроматографии для получения очищенного антитела к вирусу В гриппа, меченного щелочной фосфатазой.

Сравнительный Пример 2. Получение моноклональных антител к вирусу А гриппа.

Вакцину против НА гриппа (производства KAKETSUKEN: штамм A/New Caledonia/20/99(H1N1)(IVR-116), штамм A/Panama/2007/99(H3N2)NIB-41 и штамм B/Yamanashi/166/98), содержащую нуклеопротеин антигена гриппа, использовали в качестве иммуногена.

После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON) иммуноген вводили Balb/c мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген ввели посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей с клетками миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), при котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа и рекомбинантный нуклеопротеин антигенов вируса А гриппа (r-NP/H1N1 из штамма A/New Caledonia/20/99 и r-NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93). Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса А типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (товарный знак Tween 20) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и полученную смесь выдерживали для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После проведения реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.

Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантный нуклеопротеин вируса В гриппа (r-NP/B из B/Yamanashi/166/98), и 3 штамма гибридом (гибридома FVA2-3, гибридома FVA2-6 и гибридома FVA2-11), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа. Эти гибридомы депонировали в Международный Патентный Депозитарий Организмов (International Patent Organism Depositary) и Национальный Институт Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). Гибридома FVA2-3 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10066, гибридома FVA2-6 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10067, а гибридома FVA2-11 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10068.

Сравнительный Пример 3. Получение антитела к вирусу А гриппа, меченного щелочной фосфатазой.

Повторяя действия, описанные выше в Сравнительном Примере 1, получили меченное щелочной фосфатазой моноклональное антитело к вирусу А гриппа, используя при этом моноклональное антитело к вирусу А гриппа (FVA2-11), полученное, как описано в Сравнительном Примере 2.

Пример 3. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа.

Как показано на Фиг.2, на участки, расположенные на расстоянии 16 мм и 13.5 мм от того конца матрикса 2 (изготовленного из нитроцеллюлозной мембраны, производства MILLIPORE), где расположена зона 5 поглощения проявителя, нанесли соответственно 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу А гриппа (FVA2-11), полученного согласно Сравнительному Примеру 2, и 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу В гриппа (FrB1-03), полученного согласно Примеру 2, и высушили с получением зон 6а и 6b детектирования. На участок, расположенный на расстоянии 11 мм от конца матрикса 2 со стороны зоны 5 поглощения проявителя, нанесли антитело к щелочной фосфатазе (производства DAKO) и высушили с получением зоны 10 контроля. Затем на матрикс нанесли 5 мкл смешанного водного раствора, содержащего меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу А гриппа (5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 3, и меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу В гриппа (7.5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 1, и высушили с получением зоны меченого реагента, представляющей собой подложку 4 для меченного ферментом реагента.

Подложку 3 для проявителя получили путем нанесения (в форме линии шириной 6.1 мм) 100 мкг 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) в качестве субстрата на фильтровальную бумагу шириной 5 мм и длиной 20 мм (производства MILLIPORE) и высушивания субстрата. Описанный выше матрикс 2, подложку 3 для проявителя, подложку 4 для меченного ферментом реагента и подложку 5 для поглощения проявителя (фильтровальная бумага производства MILLIPORE шириной 10 мм, длиной 20 мм и толщиной 1 мм) закрепили в пластиковом корпусе, снабженном емкостью 11 для проявителя, получив, таким образом, показанное на Фиг.3 и 4 устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса типа А гриппа и вируса типа В гриппа.

Сравнительный Пример 4. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (традиционное устройство).

Действуя так же, как и в Примере 3, изготовили такое же устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа, как и описанное ранее в Примере 3, за исключением того, что зоны 6а и 6b детектирования задали, используя соответственно приобретенное (коммерческое) моноклональное антитело к вирусу А гриппа и коммерческое моноклональное антитело к вирусу В гриппа. Получили устройство для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (ESPLINE Influenza А&В (производства FUJIREBIO); традиционное устройство для иммунологического анализа).

Пример 4. Анализ вируса А гриппа и вируса В гриппа.

В зону 8 нанесения образца устройства 1 для иммунологического анализа, предназначенного для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленного как описано в Примере 3, нанесли 30 мкл образца подтипа вируса В гриппа, приведенного в Таблице 3 (в качестве разбавителя использовали трис буфер, рН 8.0, содержащий поверхностно-активное вещество), после чего надавили на зону запуска 12 деформируемого элемента для его деформации таким образом, чтобы погрузить подложку 3 для проявителя в емкость 11 для проявителя с выступом 3 на деформируемом элементе, и, таким образом, начали проведение анализа. Через пятнадцать минут после начала проведения анализа окрашивание зоны 10 контроля подтвердило, что проявитель достиг этой зоны. После этого визуально наблюдали окрашивание зон 6а и 6b детектирования. Результаты приведены в Таблице 3.

Таблица 3
Результаты анализа штаммов вируса В гриппа Образец Фактор разбавления Традиционное устройство для анализа Устройство для анализа по данному изобретению Окрашивание 6а 6b 6а 6b Yamanashi/166/98 х100 - + - + х200 - +/- - + х400 - - - + х800 -   - - Shanton/7/97 х400 - +W - + х800 - - - +/- х1600 - - - - Mie/1/93 х400 - + - + х800 - - - + х1600 - - - +/- B/Lee/40 х100 - + - + x1000 - + - + x10000 - - - +W x100000 - - - - B/Hokkaido/26/99* х100 - + - + x1000 - + - + x10000 - + - + x100000 - - - - Хориоаллантоисная
жидкость   - - - - MEM среда   - - - - * Результаты исследования MDCK культурального супернатанта, так как вирусы не были адаптированы к куриным яйцам.

В качестве контроля 30 мкл каждого из описанных выше образцов, приведенных в Таблице 3, проанализировали, используя традиционное устройство, изготовленное, как описано в Сравнительном Примере 4. Результаты анализов приведены в Таблице 3.

Как видно из приведенных результатов, все подтипы вируса В гриппа, которые невозможно определить с помощью традиционного устройства для анализа, оказалось возможным определить с помощью устройства по данному изобретению.

Пример 5

Используя устройство 1 для анализа, предназначенное для одновременного определения (исследования) вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленное, как описано в Примере 3, аналогично тому, как это описано в Примере 6, проверили перекрестную реактивность с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и B1 - В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30). энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans. Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. He было обнаружено взаимодействие ни с одним из этих вирусов и бактерий.

Изобретение относится к области иммунологии и вирусологии. Предложено устройство для иммунологического анализа, в котором использовано меченое мобильное антитело к вирусу гриппа В. Изобретение может быть использовано для высокоспецифичного определения наличия вируса гриппа типа В при диагностике гриппа. 1 з.п.ф-лы, 3 табл., 4 ил.

1. Устройство для иммунологического анализа на выявление вируса гриппа В, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу В гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения проявителя и зону детектирования вируса В гриппа, в которой антитело к вирусу В гриппа иммобилизовано на матриксе, причем зоны заданы на матриксе, при этом, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу В гриппа и антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования, - является либо моноклональным антителом к вирусу типа В гриппа или его антигенсвязывающим фрагментом, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса В гриппа, имеющим молекулярную массу от 60 до 75 кДа, либо моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, полученным с помощью гибридомы FrB1-03, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10070, гибридомы FrB1-07, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10071, или гибридомы FVB2-16, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10069, которые были депонированы в Международном Депозитарии в соответствии с Будапештским Соглашением.

2. Устройство для иммунологического анализа по п.1, отличающееся тем, что меткой является фермент, и устройство содержит субстрат для этого фермента в составе проявителя и/или вблизи зоны подачи проявителя.