СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к области детектирования (определения) вирусов гриппа и может быть использовано в медицинской практике для типирования вирусов гриппа, а также при проведении научно-исследовательских работ.

Известны способы детектирования вирусов, основанные на использовании оптических методов:

1) твердофазный иммунофлюоресцентный анализ [1] (Иванова В.Т., Стафеева О.А., Савицкий А.П. Использование твердофазного флюоресцентного иммунологического анализа для индикации вируса гриппа А. Вопросы вирусологии, 1988, № 3, 362-365).

При проведении анализа этим методом вирусы (в том числе вирусы гриппа), разведенные в бикарбонатном буфере, иммобилизуют на полистирольные микропланшеты. Затем производят блокировку свободных центров на поверхности микропланшета, на которых не произошла иммобилизация вирусов, раствором бычьего сывороточного альбумина. После промывки раствором фосфатного буфера рН 7.4, содержащим тритон Х-100, проводят инкубацию с сывороткой, содержащей антитела, приготовленные к вирусам гриппа А и В, путем иммунизации животных вирусами гриппа. При этом на поверхности микропланшета происходит образование комплексов антиген-антитело [2] (К.Вилли, Биология, «Мир», М., 1968, с.491), если вирусы взаимодействуют с антителами из гомологичных сывороток. На следующем этапе производят промывку раствором фосфатного буфера. Затем проводят инкубацию с иммуноглютинином, меченным копропорфирином, после чего планшет промывают фосфатным буфером для удаления несвязанных реагентов, заливают десорбирующим раствором и измеряют флуоресценцию на спектрофлуориметре.

К недостаткам иммунофлуоресцентного метода относятся многостадийность, большие временные затраты (до полутора суток), приготовление антивидовых антител, меченных флюоресцентными метками, достаточно сложная и дорогостоящая аппаратура;

2) колориметрическое выявление вирусов гриппа в супрамолекулярных комплексах [3] (Jie Song, Quan Cheng, Shimin Zhu, Raymond C. Stevens. "Smart" materials for biosensing devices: cell-mimicking supramolecular assemblies and colorimetric detection of pathogenic agents. Biomedical Microdevices, 4:3, 2002, 213-221).

При колориметрическом определении вирусов на основе супрамолекулярных комплексов изменение цвета тонких слоев этих комплексов или цвета растворов происходит при химическом взаимодействии специально подобранного агента, химически связанного с комплексом и с вирусным белком нейраминидазой. Результатом этого взаимодействия является изменение спектра поглощения комплекса вследствие происходящих в нем структурных изменений, приводящих к изменению степени сопряжения проводящего полимера полидиацетилена, входящего в состав комплекса.

Недостатками метода являются отсутствие реакции антиген-антитело, обусловливающей высокую специфичность аналитического метода, и, следовательно, невозможность использования его для детектирования активно циркулирующих в настоящее время реассортантов вирусов гриппа типа А и В, а также достаточно сложная схема процесса синтеза чувствительных компонент системы, включающая до 24 стадий.

Наиболее близким к предлагаемому способу по специфичности и простоте является иммуноферментный анализ [4] (A.Voller, O.E.Bidwell, A.Bartlett, Enzyme-immunoassays in diagnostic medicine. Theory and practice. Bull. Wrid. Hlth. Org., 1976, v.53, 55-65).

Анализ проводят на стандартных полистирольных микропланшетах отечественного или импортного производства по следующей схеме. Вирусы, разведенные в 0.1 М бикарбонатном буфере при рН 9.6, иммобилизуют на микропланшеты в течение 18 часов при 4°С. Затем производят блокировку свободных центров на поверхности микропланшета, на которых не произошла иммобилизация вирусов, раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа. После этого следует промывка раствором фосфатного буфера рН 7.4, содержащим 0.01-0.03% тритона Х-100. Затем проводят инкубацию в течение 2 часов при 37°С с сывороткой, содержащей антитела, приготовленные к вирусам гриппа типа А и В, путем иммунизации животных вирусами гриппа. При этом на поверхности микропланшета происходит образование комплексов антиген-антитело, если взаимодействие вируса происходит с гомологичной сывороткой или с сывороткой, приготовленной к вирусу со сходной антигенной структурой вирусных белков. На следующем этапе проводят стандартную промывку раствором фосфатного буфера, после которой следует инкубация в течение 1 часа при 37°С с антивидовыми иммуноглобулинами, мечеными ферментом пероксидазой. Затем опять производят промывку от несвязанных реагентов в фосфатном буфере. После этого на подготовленный таким образом планшет наносят раствор субстрата (например, 5-аминосалициловой кислоты или ортофенилдиамина или др.) и выдерживают раствор в затененном месте в течение 15-30 мин в зависимости от природы субстрата до завершения окрашивания раствора субстрата. Для предотвращения протекания медленной реакции окрашивания за счет кислорода воздуха и других окислителей процесс останавливают добавлением раствора серной кислоты. Связанную пероксидазу обнаруживают по изменению оптической плотности раствора в лунках планшета при соответствующих длинах волн с помощью устройств Мультискан-Ридер. Величина регистрируемой оптической плотности пропорциональна концентрации связанного с антителом вируса.

В случае иммуноферментных и иммунофлюоресцентных методов при детектировании вирусов гриппа известна специфичность определяемых антител и неизвестен определяемый антиген.

Недостатком прототипа является большое число операций при выполнении процедуры анализа и большие временные затраты на ее проведение (до полутора суток).

Изобретение решает задачу уменьшения длительности проведения анализа и сокращения числа операций при анализе вирусов гриппа.

Задача решается тем, что на полимерную основу, обладающую способностью связывать антитела к вирусам гриппа, наносят антитела из раствора, содержащего антитела к вирусу определенного типа. Затем несвязанные с полимером антитела удаляют путем выдерживания полимерной основы с иммобилизованными антителами в растворителе, например в воде, в течение нескольких минут. После этого на приготовленную полимерную основу наносят неизвестные (определяемые) вирусы гриппа, разведенные в физиологическом растворе. Предварительно наличие вирусов гриппа в растворе определяется классическим методом РГА (реакции гемагглютинации), проводимой с взвесью эритроцитов человека или кур, которые при взаимодействие с вирусами гриппа образуют специфические структуры, регистрируемые визуально.

При внесении вируса в реакционную смесь на поверхности полимера происходит взаимодействие антитела с антигеном с образованием комплекса антиген-антитело, если его компоненты комплиментарны. После удаления несвязанных антигенов по описанной выше процедуре и последующего высушивания поверхности при комнатной температуре на поверхность образовавшегося комплекса наносят спой жидкого кристалла. Затем пленку жидкого кристалла на поверхности тест-образца анализируют в поляризационном микроскопе. Наблюдаемые при этом в слое жидкого кристалла характерные структуры сравнивают со структурами, типичными для вирусов гриппа другого типа. Совпадение характерных особенностей структур тестируемых объектов со структурами, присущими определенному типу вирусов гриппа, позволяет произвести отнесение изучаемых вирусов к определенному типу.

Небольшое число операций при проведении анализа, их быстрота и простота аппаратурного оформления обеспечивают достижение поставленных целей - проведение детектирования вирусов в течение времени не более 1 часа.

Анализ с помощью поляризационного микроскопа оптических свойств пленки ЖК, находящейся в контакте с тонким слоем вирусных частиц, связанных с антителом, позволяет выявить специфические различия в свойствах поверхности вирусов гриппа, не обнаруживаемые с помощью ранее применявшихся оптических методов (иммуноферментный анализ, иммунофлюоресцентный анализ, колориметирический анализ супрамолекулярных комплексов), поскольку оптические свойства пленки ЖК определяются локальным поверхностным натяжением на границе раздела ЖК-вирусные частицы, а также действием диполь-дипольных, дисперсионных, Ван-дер-Ваальсовых, донорно-акцепторных, водородных связей, ионных и др. взаимодействий.

До настоящего времени такой метод анализа вирусных частиц, в том числе и вирусов гриппа, не был описан в патентной литературе, а также в научных и методических публикациях, посвященных разработке и использованию методов обнаружения различных вирусов.

Пример 1. На поверхность стеклянной пластины наносят тонкий слой полианилина, на поверхности которого при выдерживании в течение 2 минут в 0,03% водном растворе сыворотки, приготовленной к вирусу гриппа типа В, иммобилизуют антитела к вирусу гриппа типа В (гомологичная система). После этого пластину 2 минуты промывают водой и подвергают обработке вирусом типа В в 0.15 М растворе NaCl в течение 2 минут, а затем 5 минут промывают водой и высушивают на воздухе 10 минут. Затем на нее наносят декорирующий (˜ 1 мкм) слой нематического жидкого кристалла метоксибензилиденбутиланилина (МББА) в виде раствора в этиловом спирте (или другом летучем растворителе) и помещают в поле зрения поляризационного микроскопа. После испарения растворителя область локализации комплексов антиген-антитело выглядит как характерная структура, показанная на Фиг.1 (диаметр поля наблюдения 800 нм). Видно, что в этом случае на поверхности образца формируются упорядоченные подобные твердым кристаллам структуры с осью симметрии 6-го порядка. Длительность проведения анализа не превышает 30 мин.

Пример 2. На поверхность стеклянной пластины из раствора наносят тонкий слой полианилина, затем образец помещают на две минуты в 0.03% водный раствор сыворотки, содержащий антитела к вирусу гриппа типа В. После этого испытуемый образец помещают в дистиллированную воду и промывают там две минуты для удаления неиммобилизованных антител. Далее образец на 2 минуты погружают наполовину в раствор, содержащий вирусы гриппа типа А (гетерогенная система), после чего 5 минут отмывают в воде, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут. Всю поверхность пленки после проведения этих операций обрабатывают раствором жидкого кристалла метоксибензилиденбутиланилина (МББА) в этиловом спирте - образец и после испарения растворителя помещают в поле зрения поляризационного микроскопа, в котором поляризатор и анализатор размещены под углом, например, в 90°. В результате проведения этих операций на тест-пластине формируются две области (Фиг.2, диаметр поля наблюдения 800 нм). На левой стороне поля на Фиг.2 находится область пленки полианилина, последовательно обработанная антителом к вирусу гриппа типа В и затем вирусом гриппа типа А (гетерогенная система), в то время как на правой стороне находится область пленки полианилина, обработанная только антителом к вирусу гриппа типа В. Таким образом, при несовпадении типов антитела и антигена на поверхности полианилинового слоя, а также при закреплении только антигена (вируса) наблюдаемая в поляризационном микроскопе картина сильно отличается от той, которая наблюдалась в первом примере для гомологичной системе при совпадении типов вируса и антитела.

На левой половине поля Фиг.3 показана картина, возникающая в том случае, когда на поверхности полианилина иммобилизованы не антитела, а непосредственно вирусы типа А, покрытые слоем нематического жидкого кристалла. Правая половина поля представляет собой пленку полианилина, продекорированную слоем жидкого кристалла. Отчетливо заметна разница в топологии и окраске этого объекта по сравнению со случаями, когда непосредственно с поверхностью полимера взаимодействуют антитела к антигенам типов А и В.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что иммобилизованные на поверхности полианилина комплексы антиген-антитело для вирусов гриппа типов А и В при взаимодействии с нематическими жидкими кристаллами формируют различные структуры в зависимости от степени гомологии системы вируса и антитела, легко различаемые в поляризационном микроскопе. Из примеров видно также, что предлагаемый способ легко осуществим и может быть широко использован в медицинской практике и для исследования вирусов гриппа.

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен способ определения типа вирусов гриппа. Способ предусматривает последовательное нанесение на полимерную подложку антитела к известному вирусу гриппа и вируса гриппа с определяемым типом (антиген) и последующий анализ оптических характеристик. При этом на полимерную подложку, содержащую сформированный комплекс антиген-антитело, наносят слой жидких кристаллов, формирующий регистрируемое в поляризованном свете изображение. Изобретение позволяет быстро определять типы вирусов гриппа. Изобретение может быть использовано в медицине и вирусологии. 3 ил.

Способ определения типа вирусов гриппа, включающий последовательное нанесение на полимерную подложку антитела к известному вирусу гриппа и вируса гриппа с определяемым типом (антиген) и последующий анализ оптических характеристик, обусловленных образованием комплекса антиген - антитело, отличающийся тем, что на полимерную подложку, содержащую сформированный комплекс антиген - антитело, наносят слой жидких кристаллов, формирующий регистрируемое в поляризованном свете изображение, которое сравнивают с изображением, содержащим структурные элементы, присущие гомологичной системе антиген (эталонный штамм) - антитело.