СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНТЕЗА ФЛУОРЕСЦЕИНА БАКТЕРИЯМИ РОДА Pseudomonas Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/00 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по идентификации бактерий рода Pseudomonas и производстве питательных сред для этих исследований.

Известны способы определения синтеза флуоресцеина бактериями Pseudomonas с использованием вариантов питательной среды King В, различающихся источниками азота, углерода и субстрата для образования флуоресцеина. Рекомендуют (Методы общей бактериологии. В 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Ф.Герхардта и др. - М.: Мир, 1984. - С.21, 70) использовать среду King В следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат кильки -10,0; панкреатический гидролизат животных тканей USP-10,0; К₂НРO₄ - 1.5; MgSO₄·7H₂O - 1,5; агар - 14,0; вода дистиллированная - 1 л. Компоненты смешивают, доводят до рН-7,2; кипятят до растворения агара, стерилизуют в паровом стерилизаторе при +121°С 15 мин и разливают в чашки Петри. Исследуемую культуру засевают штрихом на поверхность агара, инкубируют при +25-28°С в течение 24-72 ч, учитывают результат при облучении ультрафиолетовым светом, считают положительным результатом появление флуоресцирующей зоны питательной среды вокруг участков роста бактерий.

Имеются также рекомендации использовать в составе среды King В пептон неопределенного состава и производства при следующем содержании ингредиентов (г/л): пептон - 20,0; К₂НРO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5; агар - 16,0; глицерол - 10 мл; вода дистиллированная - 1 л (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.- Киев: Наукова думка, 1990. - С.222).

Фирма Difco(CШA) производит вариант среды King В под названием Pseudomonas agar F следующего состава (г/л): бактотриптон - 10,0; бактопротеозопептон №3 - 10,0; К₂НРO₄ -1,5; MgSO₄ - 1,5; агар - 15,0; глицерол - 10 мл, вода дистиллированная - 1 л. Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С 15 мин.

Авторская пропись среды King В и методика определения флуоресцеина приведены в руководстве - Вейгант Р., Мосс У., Уивер Р., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир, 1999. - С.38-39. Состав среды King В (г/л): протеозопептон №3 (Difco) - 20,0; К₂НРO₄ - 1,5; MgSO₄·7Н₂O - 1,5; глицерол - 10 мл; агар - 15,0; вода дистиллированная - 1 л. Доводят рН среды до 7,2; разливают по 7 мл в пробирки, стерилизуют при 121°С 15 мин. Засевают скошенный агар одной каплей 24-часовой культуры, выращенной в жидкой среде, инкубируют при 35° С до 7 суток. Продукции флуоресцеина (пиовердина) способствует инкубация при 25°С.Образование пигментов обычно становится заметным в первые 3 суток. Флуоресцеин у бактерий на среде King В выявляют по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. По указанной оригинальной прописи производят среду King В фирмы bio Merieux и Sanofi Diagnostic Pasteur (Франция). Указанный способ с использованием среды King В в оригинальной прописи избран нами прототипом заявляемого изобретения.

Недостатками прототипного способа и других аналогов являются:

- отсутствие стандартного состава среды King В в связи с неопределенным составом пептонов и гидролизатов, используемых в качестве источников азота, углерода и субстрата для образования флуоресцеина;

- необходимость стерилизации питательной среды в паровом стерилизаторе при +121°С.

Целью изобретения является упрощение и повышение стандартности исследования по определению синтеза флуоресцеина бактериями рода Pseudomonas. Повышение стандартности исследования состоит в достижении полной определенности и постоянства состава питательной среды, используемой для определения синтеза флуоресцеина бактериями рода Pseudomonas.

В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемые суточные культуры бактерий засевают на плотную питательную среду, содержащую в качестве источника азота и углерода аминокислоту L- глютамин или L-глютаминовую кислоту (L-глютамат натрия), а также дополнительно NaCl, Na₂SO₄, КН₂PO₄ при следующем содержании ингредиентов в питательной среде (г/л): L-глютамин - 2,0 -5,0; или L-глютаминовая кислота (L-глютамат натрия) - 4,0-6,0; NaCl - 5,0; Na₂SO₄ - 2,0; KH₂PO₄ - 0,5; К₂НРO₄ - 2,0; MgSO₄·7H₂O - 1,5; агар - 15,0; глицерол - 10 мл, вода дистиллированная - 1 л; рН-7,0±0,2; при этом ингредиенты растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин и без последующей стерилизации в паровом стерилизаторе разливают в стерильные чашки Петри; инкубируют посевы при +28°С в течение 24-48 ч, после чего облучают газон бактерий ультрафиолетовым светом и определяют наличие флуоресцеина по желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды.

Отличительный существенный признак способа - использование в питательной среде в качестве источника азота и углерода аминокислоты L-глютамина (2-5 г/л) или L-глютаминовой кислоты (L-глютамата натрия 4-6 г/л).

Отличительный существенный признак способа не применялся в прототипе, аналогах и не известен из уровня техники.

Отличительный существенный признак способа не следует явным образом из уровня техники. Он установлен нами неожиданно в ходе исследований профилей утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственного единого источника азота и углерода, выполненных на 100 штаммах Pseudomonas aeruginosa, 40 штаммах Р. putida, 10 штаммах Р. fluorescens, включая типовые штаммы, а также на типовых штаммах 9 других видов псевдомонад (Р. chlororaphis, P. aureofaciens, P. stutzeri, Р. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. mendocina, P. fragi, P. luteola, Р. oryzihabitans). Оказалось, что универсальным субстратом для роста всех штаммов флуоресцирующих видов псевдомонад (Р. aeruginosa, P. putida, Р. ftuorescens, Р. aureofaciens, P. chlororaphis) являются L-глютамин, L-глютаминовая кислота (L-глютамат натрия), L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-аланин, L-пролин). Дальнейшее исследование этих аминокислот и качестве единственного субстрата для образования флуоресцеина, источника азота и углерода в составе среды King В (без глицерина) показало, что только L-глютамин и L-глютаминовая кислота (L-глютамат натрия) обеспечивают эффективную продукцию флуоресцеина всеми штаммами флуоресцирующих видов псевдомонад. Остальные четыре аминокислоты являлись источником флуоресцеина только для единичных штаммов псевдомонад и продукция флуоресцеина была слабой. Все прочие аминокислоты не пригодны ввиду вариабельности их утилизации различными видами псевдомонад.

Отличительный существенный признак способа непосредственно определяет достижение поставленной цели: повышается стандартность исследования ввиду замены пептона или гидролизатов неопределенного состава из естественного сырья одним веществом - L-глютамин или L-глютаминовая кислота (L-глютамат натрия) известного химического строения в известном количестве, то есть создается и используется синтетическая питательная среда строго определенного качественного и количественного состава; исследование упрощается ввиду исключения стерилизации питательной среды заявляемого способа в паровом стерилизаторе при +121°С, так как минимальная синтетическая среда заявляемого способа исключает рост посторонних ауксотрофных бактерий, в том числе аэробных спорообразующих бактерий. Для изготовления и применения питательной среды достаточно кипятить ее (+100°С) в течение 5 мин, что уничтожает все вегетативные формы бактерий. Возможно сохранение спор анаэробных и аэробных спорообразующих бактерий, однако споры анаэробов не прорастают, ввиду проведения исследования в аэробных условиях, споры аэробов рода Bacillus не прорастают, так как являются ауксотрофами и не могут расти на минимальной синтетической среде. Опыт использования питательной среды заявляемого способа, обеспложенной только кипячением в течение 5 мин, показал отсутствие прорастания среды посторонней микрофлорой во всех случаях инкубации посевов псевдомонад в течение 48 ч при +28°С (150 чашек Петри) и инкубации незасеянной среды в чашках Петри при +28°С и +37°С в течение 7 суток (40 чашек). Более того, стерилизовать питательную среду в паровом стерилизаторе нецелесообразно, так как снижается интенсивность флуоресценции.

Второй отличительный существенный признак - использование в составе питательной среды дополнительно NaCl (5 г/л), Na₂SO₄ (2,0 г/л), КН₂PO₄ (0,5 г/л). Эти компоненты необходимы для обеспечения утилизации бактериями L-глютамина и L-глютаминовой кислоты (L-глютамата натрия) в составе созданной синтетической среды и содержатся в ней в точно определенном составе. Этот признак не применялся в прототипе и аналогах.

Третий отличительный существенный признак - инкубация посевов бактерий при температуре 28°С в течение 24-48 ч. Инкубацию следует проводить только при 28°С, так как этот режим обеспечивает рост всех видов псевдомонад; инкубация при 35-37°С подавляет рост некоторых видов психротрофных флуоресцирующих псевдомонад и значительно угнетает продукцию флуоресцеина у остальных видов псевдомонад. Посевы бактерий достаточно инкубировать в течение 24-48 ч, что обеспечивает выявление флуоресцеина у всех штаммов; в более поздние сроки инкубации снижается интенсивность флуоресценции.

Существенными признаками способа являются некоторые компоненты питательной среды: MgSO₄·7H₂O в используемой концентрации стимулирует продукцию флуоресцеина; наличие двухзамещенного фосфата калия и однозамещенного фосфата калия в используемом соотношении обеспечивает заданный оптимальный рН среды без дополнительной корректировки. Содержащийся в среде глицерол не является субстратом для образования флуоресцеина и, по нашим данным, не стимулирует продукцию флуоресцеина псевдомонадами. Он также не обязателен как источник углерода для псевдомонад. При его отсутствии в питательной среде заявляемого способа продукция флуоресцеина псевдомонадами имеет такую же частоту и интенсивность, как при его наличии. Однако использовать его в составе среды целесообразно, так как он предохраняет среду от выпадения кристаллов солей (протектор кристаллизации).

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий рода Pseudomonas, выделенную от больного, засевают петлей на сектор питательной среды заявляемого способа (1/6 часть чашки Петри), состав и приготовление которой указаны в примечании; инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°С, после чего облучают газон бактерий ультрафиолетовым светом и учитывают результат - наличие желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды указывает на образование флуоресцеина и принадлежность исследуемых бактерий к группе флуоресцирующих псевдомонад. Контроль - наличие флуоресцеина у контрольного штамма Р. aeruginosa ATCC 27853, используемого по такой же методике. Посторонней микрофлоры питательной среды не обнаружено. Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды добавляют сухую смесь ингредиентов, содержащую (г/л): L-глютамин - 2,0; NaCl - 5,0; Na₂SO₄ - 2,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 2,0; MgSO₄·7H₂O - 1,5; агар бактериологический - 15,0; растворяют при нагревании до кипения, добавляют 10 мл глицерола, кипятят в течение 5 мин, после чего разливают в стерильные чашки Петри. Среда прозрачная, пригодна к использованию в течение 7 суток при хранении от +4°С до +8°С.

Пример 2. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий рода Pseudomonas, выделенную из пищевых продуктов, засевают петлей на сектор питательной среды заявляемого способа, содержащей 5,0 г/л L-глютамина (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1). Инкубируют посевы при 28°С в течение 24 ч, после чего облучают газон бактерий ультрафиолетовым светом и учитывают результат - наличие желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды указывает на образование флуоресцеина и принадлежность исследуемых бактерий к группе флуоресцирующих псевдомонад. Контроль - наличие флуоресцеина у контрольного штамма Р. aeruginosa ATCC 27853, используемого по такой же методике. Посторонней микрофлоры питательной среды не обнаружено.

Пример 3. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий рода Pseudomonas, выделенную из воды реки Невы, засевают петлей на сектор питательной среды заявляемого способа, содержащей 4,0 г/л L-глютамата натрия (остальной состав и методика приготовления питательной среды по примечанию к примеру 1), инкубируют посевы при 28°С в течение 24 ч, после чего облучают выросший газон бактерий ультрафиолетовым светом и учитывают результат - наличие желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды указывает на образование флуоресцеина и принадлежность исследуемых бактерий к группе флуоресцирующих псевдомонад. Контроль - наличие флуоресцеина у контрольного штамма P.aeruginosa ATCC 27853, используемого по такой же методике. Посторонней микрофлоры питательной среды не обнаружено.

Пример 4. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий рода Pseudomonas, выделенную от больного с раневой инфекцией, засевают на сектор питательной среды заявляемого способа, содержащей 6,0 г/л L - глютамата натрия (остальной состав и методика приготовления питательной среды по примечанию к примеру 1), инкубируют посевы при 28°С в течение 24 ч, после чего облучают выросший газон бактерий ультрафиолетовым светом и учитывают результат - наличие желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды указывает на продукцию флуоресцеина и принадлежность исследуемых бактерий к группе флуоресцирующих псевдомонад. Контроль - наличие флуоресцеина у контрольного штамма Р. aeruginosa ATCC 27853, используемого по такой же методике. Посторонней микрофлоры питательной среды не обнаружено.

Таким образом, при всех предельных концентрациях основных компонентов питательной среды заявляемого способа получены четкие и быстрые результаты обнаружения продукции флуоресцеина псевдомонадами при отсутствии роста посторонней микрофлоры.

Сравнительное изучение диагностической чувствительности и специфичности синтетической питательной среды заявляемого способа, прототипной среды King В фирмы bio Merieux (Франция) и питательной среды Pseudomonas agar F фирмы Difco (США), проведенное с использованием группы флуоресцирующих псевдомонад (40 штаммов Р. aeruginosa, в том числе типовой штамм АТСС 10145, 10 штаммов P.putida биовара А, в том числе типовой штамм АТСС 12633, 2 штамма P.putida биовара В, 10 штаммов Р. fluorescens, в том числе типовой штамм АТСС 13525, типовой штамм Р. aureofaciens АТСС 13985) и группы нефлуоресцирующих псевдомонад (типовые штаммы Р. stutzeri АТСС 17588, Р. alcaligenes АТСС 14909, Р. pseudoalcaligenes АТСС 17440, Р. mendocina АТСС 25411, Р. luteola CIP 102995 Т, P. oryzihabitans CIP 102996 Т) показало:

все питательные среды имеют 100% специфичность; питательная среда заявляемого способа и прототипная среда King В фирмы bio Merieux имеют равную чувствительность (95% к Р. aeruginosa и 100% к остальным видам флуоресцирующих псевдомонад), питательная среда Pseudomonas agar F фирмы Difco имеет более низкую чувствительность к Р. aeruginosa - 90%. Вариабельность результатов определения продукции флуоресцеина псевдомонадами на средах различного производства обусловлена нестандартностью субстратов для образования флуоресцеина (пептона). Синтетическая среда заявляемого способа стандартна по составу, позволяет получить результаты на уровне лучших сред этого предназначения более проста по составу и методике приготовления.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при бактериологических исследованиях по идентификации бактерий Pseudomonas и производстве питательных сред для этих исследований. Способ предусматривает приготовление питательной среды путем растворения при нагревании до кипения в 1 литре дистиллированной воды L-глютамина или L-глютаминовой кислоты (L-глютамата натрия), NaCl, Na₂SO₄, KH₂РO₄, K₂НРО₄ MgSO₄·7H₂O, агара в заданном количестве компонентов. Добавляют глицерол в заданном количестве. Полученную питательную среду кипятят в течение 5 минут. При этом рН среды -7,0±0,2. После чего осуществляют посев суточной культуры Pseudomonas в питательную среду вышеуказанного состава. Посевы инкубируют в течение 24-48 при температуре 28°C. Затем облучают ультрафиолетовым светом и определяют наличие флуоресцеина по желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды. Изобретение позволяет упростить способ приготовления питательной среды с сохранением питательных свойств среды и повысить ее стандартность.

Способ определения синтеза флуоресцеина бактериями рода Pseudomonas, предусматривающий посев суточной культуры бактерий рода Pseudomonas на питательную среду, содержащую источники азота и углерода, КН₂РO₄, MgSO₄·7H₂O, глицерол, агар и дистиллированную воду; инкубирование бактерий, облучение ультафиолетовым светом, определение наличия флуоресцеина по желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды, отличающийся тем, что в качестве источника азота и углерода питательная среда содержит L-глютамин или L-глютаминовую кислоту (L-глютамат натрия), а также дополнительно содержит NaCl, Na₂SO₄, KH₂PO₄ при следующем содержании ингредиентов, г/л:
L-глютамин или 2,0-5,0 L-глютаминовая кислота (L-глютамат натрия) 4,0-6,0 NaCl 5,0 Na₂SO₄ 2,0 KH₂PO₄ 0,5 K₂HPO₄ 2,0 MgSO₄·7H₂O 1,5 агар 15,0 глицерол 10 мл вода дистиллированная 1 л