СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Shewanella Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к области микробиологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий рода Shewanella и производстве питательных сред для этих исследований.

Известен способ выделения и идентификации бактерий рода Shewanella непосредственно из исходного материала на морском 2216 агаре (Difco Lab.) или питательном агаре (Oxoid) без предварительного обогащения. Колонии бактерий Shewanella часто опознаются по их бледной или розовой (цвета лосося) окраске (Bowman J.P. Genus XIII. Shewanella Mac Donell and Colwell 1986,355 (Effective publication: Mac Donell and Colwell 1985,180), in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2^nd ed., Garriti G.M., Brenner D.J., Krieg N.R., and Staley J.T., Eds., New York: Springer, 2005, Vol.2, part B, pp.480-491).

Известен также способ выделения и идентификации бактерий рода Shewanella на традиционных питательных средах, включая агар МакКонки, на котором они хорошо растут, образуя через 18-24 ч инкубации желто-коричневые колонии диаметром 1-2 мм. Далее изоляты из желто-коричневых колоний идентифицируют родовыми тестами (О/Ф тест с глюкозой на отсутствие ферментации, тест на наличие оксидазы, тест на продукцию сероводорода на среде Клиглера). Затем используют тесты для идентификации видов S.putrefaciens, S. algae. Оба вида гидролизуют желатин, имеют нитратредуктазу, орнитиндекарбоксилазу; в отличие от S.putrefaciens S.algae обладает бета-гемолизом на кровяном агаре с кровью барана, растет при 42°C и в питательной среде с 6% NaCl. Автоматизированные системы идентификации не различают виды S.putrefaciens, S.algae, так как в программных интерфейсах систем 20Е, 20 NE,I D 32GN, Vitek базы данных включают только вид S.putrefaciens (Н.М.Holt, В.Gahrn-Hansen, В.Brunn Shewanella algae and Shewanella putrefaciens: clinical and microbiological characteristics. Clin. Microbiol. Infect. 2005; Vol.11, №5: p.347-352).

Известен способ выделения и идентификации бактерий Shewanella путем предварительного накопления в аэробных условиях в жидкой среде, содержащей 1% пептона, 1% хлорида натрия и 0,1% желчных солей (Difco). После последующего пересева на DHL Agar (deoxycholate-hydrogen sulfide-lactose agar) и инкубации в аэробных условиях отбирают колонии неферментирующих, продуцирующих сероводород бактерий. Изоляты окончательно идентифицируют как Shewanella и различные виды (S.putrefaciens, S. algae) дополнительными таксономическими тестами: определение оксидазы, ферментации и окисления углеводов на О/Ф среде, липазы, желатиназы, уреазы, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, продукции сероводорода и триметиламина, роста на SS-arape и цитратной среде Симмонса, роста на питательном агаре с 1.5% хлорида натрия при 37°C и 42°C в течение 7 суток и 14 суток при 4°C; толерантности к 6% хлорида натрия при 30°C в течение 48 ч; гемолиза на кровяном агаре с кровью барана при 30°C в течение 48 ч (Н.Nozue, Т.Hayashi, Y.Hashimoto, Т.Ezaki, К.Hamasaki, К.Ohwada, Y.Terawaki. Isolation and Characterization of Shewanella alga from Human Clinical Specimens and Emendation of the Discription of S.alga Simidu et aL, 1990, 335. Intern. J.System. Bacteriology, Oct. 1992, Vol.42, No 4, p.628-634). Примечание к способу. Состав и применение используемой в способе питательной среды DHL Agar acc. to Sakasaki (Merck Microbiology Manual 12^th Edition, 2005, p.262-263). Состав, г/л: пептон из казеина 10,0; пептон из мяса 10,0; экстракт мяса 3,0; лактоза 10,0; сахароза 10,0; L-цистеин хлорид 0,2; цитрат натрия 1,0; дезоксихолат натрия 1,5; тиосульфат натрия 2,0; аммония железа (III) цитрат; нейтральный красный 0,03; агар 15,0; вода дистиллированная 1 л; pH 7,2±0,2. Приготовление среды: все компоненты суспендируют в воде, растворяют при нагревании (не стерилизовать в паровом стерилизаторе), разливают в чашки Петри. Посевы инкубируют аэробно при 35°C в течение 24-48 ч. Колонии ферментирующих лактозу или сахарозу бактерий имеют розовую или красную окраску; колонии неферментирующих их бактерий бесцветные; колонии бактерий, продуцирующих сероводород, приобретают черную окраску. Вид колоний: Salmonella - бесцветные с черным центром; Citrobacter - бесцветные. иногда с черным центром; Proteus - бесцветные, окруженные темно-коричневой зоной, центр имеет слабую черную окраску; Escherichia coli - красные; Shewanella - бесцветные с черным центром.

Прототипом заявляемого способа нами избран способ по H.Nozue, T.Hayashi et al с использованием питательной среды DHL Agar, так как в обоих способах выделение и идентификация бактерий Shewanella проводится на плотных питательных средах по признаку продуцирования сероводорода.

Недостатками прототипного способа и аналогов являются:

- недостаточная специфичность идентификации колоний бактерий Shewanella на среде первичного посева ввиду возможного наличия колоний других родов бактерий с такими же дифференцирующими признаками (присутствие на среде DHL Agar бесцветных колоний с черным центром у продуцирующих сероводород бактерий Salmonella, Citrobacter, Proteus; наличие на питательном агаре (Oxoid) колоний с розовой окраской бактерий Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, Roseomonas spp.; наличие на среде МакКонки желто-коричневых колоний бактерий Pseudomonas spp., Roseomonas spp.);

- сложность исследования по идентификации бактерий рода Shewanella ввиду необходимости использования дополнительных тестов для изучения изолированных колоний (определение оксидазы, ферментации и окисления углеводов О/Ф тестом, продукции сероводорода).

Целью изобретения является повышение специфичности и упрощение исследования по выделению и идентификации бактерий рода Shewanella.

В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал засевают на плотную питательную среду, содержащую в качестве ингибитора посторонней микрофлоры иргазан (0,14-0,2 г/л) и рифампицин (0,0005-0,001 г/л); тиосульфат натрия (0,35 г/л), соль Мора, сорбит, бромтимоловый синий, твин-80, хлорид кальция, хлорид натрия, гидроксид натрия при следующем содержании ингредиентов, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0; пептон ферментативный из мяса - 12,0; NaCl - 6,0; твин- 80 - 5,0; CaCl₂ - 0,2; Na₂S₂O₃·5H₂0 - 0,35; (NH₄)₂SO₄·FeSO₄·6H₂O - 0,25; сорбит - 13,0; бромтимоловый синий - 0,08; иргазан (DP-300) - 0,14-0,2; рифампицин - 0,0005-0,001; NaOH - 0,8; агар - 12,0; вода дистиллированная - 1 л; pH 7,2±0,2; при этом гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия, агар растворяют при нагревании, стерилизуют в течение 20 мин при 121°C, после чего в горячую среду добавляют остальные ингредиенты, разливают в стерильные чашки Петри; посевы инкубируют при 37°C и/или 28°C в аэробных условиях в течение 24-48 ч; определяют принадлежность выделенных бактерий к роду Shewanella по наличию колоний зеленого цвета с черным центром или темно-серых, окруженных зоной мутного преципитата в питательной среде.

Отличительный существенный признак способа - использование в питательной среде в качестве ингибитора посторонней микрофлоры иргазана (0,14-0,2 г/л) и рифампицина (0,0005-0,001 г/л). Отличительный существенный признак не применялся в прототипе и аналогах, а также не известен из уровня техники. Нами впервые установлен на выделенных штаммах высокий уровень устойчивости бактерий рода Shewanella (S.algae, S.putrefaciens) к иргазану: 128-256 мг/л. Это позволило использовать иргазан (DP-300) в питательной среде заявляемого способа в диапазоне таких высоких концентраций (0,14-0,2 г/л), которые не используются в известных селективных средах с иргазаном, например в питательной среде для выделения иерсиний CIN-Agar (Hi-Media) содержание иргазана 0,004 г/л; в питательной среде для выделения псевдомонад Pseudomonas Isolation Agar (Hi-Media, Difco) 0,025 г/л иргазана. Концентрация рифампицина в питательной среде определена нами экспериментально: только в диапазоне 0,0005-0,001 г/л рифампицин не угнетает рост шеванелл и продукцию ими сероводорода при эффективном подавлении роста грамположительной микрофлоры. При этом питательная среда заявляемого способа имеет высокую аналитическую чувствительность: 1-2 КОЕ/мл^-1 бактерий Shewanella (S.algae, S.putrefaciens).

Отличительный существенный признак способа непосредственно определяет достижение поставленной цели - повышение специфичности выделения и идентификации бактерий рода Shewanella. При изучении 80 штаммов 30 видов 24 родов бактерий было установлено, что иргазан и рифампицин в составе среды заявляемого способа полностью подавляют рост бактерий рода Salmonella (S.enterica serovar Enteritidis, S.enterica serovar Typhimurium) и рода Proteus (P.vulgaris, P.mirabilis, P.penneri), продуцирующих сероводород, но не подавляет роста бактерий рода Citrobacter (комплекса С.freundii, продуцирующих сероводород). Таким образом, резко сокращается количество видов бактерий, колонии которых необходимо различать от колоний шеванелл по признаку образования сероводорода. Кроме того, указанные ингибиторы полностью подавляют рост бактерий родов Escherichia, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Hafnia, Staphylococcus, Bacillus (B.subtilis),но не подавляют рост бактерий родов Serratia, Morganella, Providencia (P.rettgeri), Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Achromobacter, Enterococcus.

Второй отличительный существенный признак способа - использование комплекса тиосульфат натрия (0,35 г/л), соль Мора, сорбит для выявления продукции сероводорода бактериями Shewanella и подавления образования сероводорода бактериями Citrobacter. Этот отличительный существенный признак не применялся в аналогах и только один его компонент (тиосульфат натрия) применяется в прототипе. Отличительный существенный признак не следует явным образом из уровня техники. Нами экспериментально установлено, что только значительно уменьшенная концентрация тиосульфата натрия (0,35 г/л), в отличие от концентрации его в прототипе (2,0 г/л), обеспечивает в присутствии соли Мора и сорбита полное подавление образования сероводорода бактериями Citrobacter при обильном образовании сероводорода в колониях бактерий Shewanella. Отличительный существенный признак обеспечивает непосредственное достижение поставленной цели - повышение специфичности выделения и идентификации бактерий шеванелла, так как на питательной среде заявляемого способа все колонии с черной окраской (продуцирующие сероводород) будут содержать только бактерии шеванелла. Бромтимоловый синий и гидроксид натрия в питательной среде обеспечивают оптимальный pH среды и дополнительно дифференцируют бактерии цитробактер (желтая окраска) и шеванелла (зеленая окраска).

Третий отличительный существенный признак способа - использование комплекса твин-80 и хлорида кальция для выявления липазы бактерий. Этот признак не применялся в прототипе и аналогах, но известен из уровня техники. Он непосредственно обеспечивает достижение поставленной цели повышения специфичности выделения и идентификации шеванелл, так как дополнительно дифференцирует колонии шеванелл, имеющих липазу (зона мутного преципитата вокруг колоний), от колоний бактерий цитробактер без липазы (нет зоны преципитата).

Совокупность указанных отличительных существенных признаков определяет упрощение выделения и идентификации бактерий рода Shewanella, так как выявление колоний Shewanella по признаку образования сероводорода, а также по наличию липазы и отсутствию ферментации сорбита надежно обеспечивает прямую идентификацию этих бактерий на питательной среде заявляемого способа, что исключает необходимость постановки дополнительных таксономических тестов родовой идентификации.

Существенными признаками способа являются некоторые компоненты питательной среды, которые обеспечивают питательные потребности бактерий Shewanella, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0; пептон ферментативный из мяса 12,0; хлорид натрия 6,0; агар 12,0. Эти компоненты соответствуют составу коммерческой питательной среды «питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)», что удобно для приготовления среды заявляемого способа. Выращивание посевов необходимо проводить при 37°C и/или 28°C, так как некоторые виды бактерий рода Shewanella (S.baltica) не растут при 37°C.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1. Исследуемый материал - эксудат из грудной полости больного П. засевают петлей на питательную среду заявляемого способа в чашке Петри, состав и приготовление которой указаны в примечании; инкубируют посевы при 37°C в течение 24 ч в аэробных условиях и учитывают результат: наличие на среде колоний диаметром 2-3 мм зеленого цвета с черным центром, окруженных зоной мутного преципитата в питательной среде, указывает на принадлежность их к роду Shewanella; сопутствующие колонии диаметром 3 мм желтой окраски без почернения, окруженные зоной мутного преципитата, относятся к другому роду бактерий. Контрольная идентификация выделенных изолятов дополнительными тестами видовой идентификации показала, что бактерии, выделенные из зеленых колоний с черным центром, окруженных зоной преципитации, относятся к виду Shewanella algae; бактерии из желтых колоний без почернения, окруженных зоной преципитата, относятся к виду Serratia marcescens.

Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0; пептон ферментативный из мяса - 12,0; NaCl - 6,0; агар - 12,0; растворяют при нагревании, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°C в течение 20 мин; затем в горячую среду добавляют твин-80 (стерильный) - 5 мл; CaCl₂ - 0,2 (2 мл стерильного 10% раствора CaCl₂); тиосульфат натрия - 0,35; соль Мора - 0,25; сорбит 13,0; бромтимоловый синий - 0,08 (5 мл 1,6% водного раствора); иргазан (DP-300) - 0,14 (7 мл 2% раствора в 1 N растворе NaOH); рифампицин - 0,0005 (0,5 мл 0,1% раствора на диметилсульфоксиде); NaOH - 0,8 (20 мл 1 N раствора NaOH); pH 7,2±0,2; разливают в стерильные чашки Петри. Среда имеет зеленую окраску, прозрачная, пригодна к использованию в течение 14 суток при хранении от +4°С до +8°С. Контроль питательной среды - наличие колоний диаметром 2-3 мм зеленого цвета с черным центром, окруженных зоной мутного преципитата при использовании контрольного штамма Shewanella algae 68 по методике примера 1.

Пример 2. Исследуемый материал - воду из реки Невы 0,1 мл растирают шпателем на питательной среде заявляемого способа в чашках Петри, содержащей иргазан 0,2 г/л и рифампицин 0,001 г/л (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1). Инкубируют посевы при 28°C в течение 48 ч, после чего учитывают результат - наличие на среде двух колоний диаметром 3-4 мм зеленого цвета с широкой черной зоной в центре, окруженных мутной зоной преципитата в питательной среде, указывает на их принадлежность к роду Shewanella; выявлены также колонии других родов бактерий - желтого цвета диаметром 3 мм без зоны преципитации; диаметром 2 мм синего цвета с зоной преципитации; диаметром 3 мм синего цвета с широкой зоной преципитации. Контрольная идентификация выделенных изолятов показала, что бактерии из одной зеленой колонии с черным центром и зоной преципитации относятся к виду Shewanella putrefaciens; бактерии из второй такой же колонии относятся к виду Shewanella baltica; бактерии из колоний желтого цвета диметром 3 мм без зоны преципитации являются Citrobacter freundii; бактерии из колоний синего цвета диаметром 2 мм с зоной преципитации - Stenotrophomonas maltophilia; бактерии из колоний синего цвета диаметром 3 мм с широкой зоной преципитации - Aeromonas caviae.

Таким образом, при всех предельных концентрациях основных компонентов питательной среды заявляемого способа (иргазана, рифампицина), вариантах температурного режима (37°C и 28°C) и времени экспозиции (24-48 ч) получены четкие результаты выявления и идентификации бактерий рода Shewanella.

При изучении на питательной среде заявляемого способа посевов 30 штаммов бактерий, продуцирующих сероводород (по 5 штаммов Salmonella enterica serovar Enteritidis, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Citrobacter freuindii, Citrobacter braakii) и 48 штаммов других 26 видов бактерий (кроме Shewanella), указанных ранее, не выявлено ни одного ложноположительного результата их идентификации как Shewanella, то есть заявляемый способ обладает высокой аналитической специфичностью. При этом питательная среда заявляемого способа обладает высокой аналитической чувствительностью для бактерий Shewanella - 1-2 КОЕ/мл^-1.

Заявляемый способ выделения и идентификации бактерий рода Shewanella упрощает данное исследование, так как на питательной среде заявляемого способа достигается прямая родовая идентификация Shewanella по типу колоний без дополнительных исследований.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий Shewanella и производстве питательных сред для этих исследований. Способ предусматривает посев исследуемого материала на питательную среду, содержащую панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон ферментативный из мяса, NaCl, твин-80, CaCl₂, тиосульфат натрия (Na₂S₂O₃×5Н_зO), соль Мора ((NH₄)₂SO₄ x FeSO₄×6Н₂О), сорбит, бромтимоловый синий, иргазан (DP-300), рифампицин, NaOH, агар и дистиллированную воду в заданных соотношениях. Растворяют при нагревании панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон, NaCl, агар, стерилизуют при 121°С в течение 20 мин, с последующим добавлением в горячую среду остальных указанных выше ингредиентов. Проводят инкубирование посевов на питательной среде в аэробных условиях при температуре 37°С и/или 28°С в течение 24-48 ч с последующим учетом результата по наличию колоний зеленого цвета с черным центром или темно-серых, окруженных зоной мутного преципитата в питательной среде. Изобретение позволяет упростить и повысить специфичность выделения и идентификации бактерий к роду Shewanella.

Способ выделения и идентификации бактерий рода Shewanella, предусматривающий посев исследуемого материала на питательную среду, содержащую источники азота, углерода, серы, углеводы, ингибиторы посторонней микрофлоры, индикаторы рН и образования сероводорода, агар и дистиллированную воду; инкубирование посевов при 37°С и/или 28°С в аэробных условиях в течение 24-48 ч; определение принадлежности выделенных бактерий к роду Shewanella по наличию колоний зеленого цвета с черным центром или темно-серых, окруженных зоной мутного преципитата в питательной среде, отличающийся тем, что питательная среда содержит в качестве ингибитора посторонней микрофлоры иргазан (0,14-0,2 г/л) и рифампицин (0,0005-0,001 г/л); тиосульфат натрия (0,35 г/л); соль Мора, сорбит, бромтимоловый синий, твин-80, хлорид кальция, хлорид натрия, гидроксид натрия при следующем содержании ингредиентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0 пептон ферментативный из мяса 12,0 NaCl 6,0 твин-80 5,0 CaCl₂ 0,2 Na₂S₂O₃·5H₂O 0,35 (NH₄)₂SO₄·FeSO₄·6H₂O 0,25 сорбит 13,0 бромтимоловый синий 0,08 иргазан (DP-300) 0,14-0,2 рифампицин 0,0005-0,001 NaOH 0,8 агар 12,0 вода дистиллированная 1 л

рН 7,2±0,2; при этом гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия и агар растворяют при нагревании, стерилизуют в течение 20 мин при 121°С, после чего в горячую среду добавляют остальные ингредиенты.