СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКАРДИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 1996 года по МПК A61K39/385 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может найти применение в биотехнологии.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения антикардиальных антител (АКА) иммунофлюоресцентным методом с использованием в качестве антигенного материала гистологических срезов сердечной ткани [1]
Однако этот метод имеет ряд ограничений: недостаточная чувствительность, длительная постановка реакции (48 ч), однократное применение антигенного материала, субъективность оценки результатов, затруднения при массовом обследовании населения. Основным недостатком метода является то, что в реакции непрямой иммунофлюоресценции участвуют только поверхностные клеточные антигены. Применение ультразвукового дезинтеграта сердца крысы с последующей его иммобилизацией в полиакриламидный гель (ПААГ) позволяет освободить глубоколежащие антигенные структуры и использовать его в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

Цель изобретения повышение антигенной активности препарата.

Поставленная цель достигается за счет замены срезов сердца лабораторных животных препаратом иммобилизированного гранулированного сердечного материала с магнитными свойствами, который получают путем включения ультразвукового дезинтеграта сердца белой крысы в структуру ПААГ, что позволяет прочно фиксировать эти биополимеры, стабилизировать их с сохранением биологических свойств. Полученный носитель инертен, устойчив к физико-химическому и биологическому воздействиям, что позволяет длительно хранить его.

Получение гранулированного препарата осуществляется в потоке газообразного азота за счет создания эмульсии вода в масле с включением магнитного материала окиси железа с размером частиц 0,05-5 мкм. Использование одной партии гранул препарата со стандартной сферической формой и включением магнитного материала стандартизирует результаты исследования, облегчает манипуляции с ним.

Получение препарата с иммобилизированным антигенным материалом для определения АКА и постановка реакции иммунофлюоресценции с ним поясняется следующими примерами:
П р и м е р 1: Получение ультразвукового дезинтеграта.

Ультразвуковой дезинтеграт ткани сердца белой крысы, содержащий весь комплекс антигенов, получали на приборе МСЕ при 20 кГц и t -4^оС, после чего его концентрировали через полупроницаемую мембрану SM 132000 фирмы Sartomus (ФРГ) с применением вакуумного насоса.

П р и м е р 2. Иммобилизация комплексного антигенного материала в структуру ПААГ.

В 2 мл водорастворимого комплексного материала сердечной ткани растворяли соответственно 100 и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида.

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл СПЕН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке, сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР), 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония и через 1-2 мин добавляли 2 мл дезинтеграта с растворенными мономерами и 20 мкл NN, N'N'- тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации в течение 10-15 мин гранулы отмывали ацетоном и ЗФР с твин-20 (0,5%) 3-5 раз и инкубировали 30 мин в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина для исключения неспецифического взаимодействия во время постановки реакции. Полученные гранулы имели стандартную сферическую форму с размерами 10-100 мкм, препарат хранили в ЗФР с 0,01% формалина. Из полученных гранул готовится 10% -ная взвесь. Постановку реакции осуществляли в пробирках или планшетах из расчета 20 мкл 10% взвеси гранул на одну пробу.

П р и м е р 3. Постановка реакции иммунофлюоресценции на иммобилизированном гранулированном антигенном препарате для определения АКА.

Для отмывки от консерванта в лунку планшета вносили 0,5 мл ЗФР и добавляли 20 мкл 10%-ной взвеси гранул, ЗФР отсасывали и затем вносили 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10 и инкубировали в течение 30 мин при 37^оС. После этого сыворотку удаляли и гранулы трижды промывали ЗФР с твин-20 (0,05% ) и трижды простым ЗФР. Выявление специфических антител осуществляли коммерческой видовой люминесцирующей сывороткой. После инкубации 30 мин при 37^оС гранулы отмывали в последовательности, описанной выше. Выявление уровня свечения микрогранул осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической приставкой ФМЭЛ-IА. К насадке подключали источник тока УБПВ-1 и цифровой вольтметр Щ-4300. Работу проводили при напряжении 1800 В, светофильтры возбуждения света СЭС 24-4, СС-15-4, интерференционный светофильтр фотометрической насадки МАХ-525 НМ. Увеличение объектива 90, окуляра х5. Предметное стекло с фиксированными на нем гранулами устанавливали на столике микроскопа и находили их в поле зрения объектива. Выбранный зонд (0,5) фотометрической насадки совмещали с фотометрируемым участком гранулы и при максимально закрытой диафрагме снимали цифровые значения флюоресценции гранул на вольтметре. Высчитывали среднее значение свечения 6 гранул, а также среднее значение флюоресценции фона. Разница свечения гранул и фона выражается в относительных единицах флюоресценции (мв) и характеризует интенсивность свечения препарата. Положительной считали интенсивность флюоресценции гранул, достоверно отличающуюся от интенсивности свечения контрольных параметров. При отсутствии фотометрической насадки интенсивность свечения можно измерять классическим методом по 4-балльной системе.

П р и м е р 4. Определение чувствительности препарата.

Для доказательства чувствительности препарата ставили реакцию иммунофлюоресценции с использованием 40 сывороток больных ревматизмом. Традиционным методом (на срезах сердца белой крысы) АКА выявлены у 28 человек, в то время как на иммобилизированном антигенном препарате АКА выявлены в 100% случаев, причем титр АКА на срезах в основном колебался от 1:5-1:40, в 7% случаев от 1: 80-1:320, в то время как на иммобилизированном гранулированном антигенном материале в 95% случаев титр составлял 1:40-1:320, а в 5% 1:640. Чувствительность повышается за счет увеличения концентрации антигена в иммобилизированном препарате (повышение концентрации антигена в 4 раза, увеличение чувствительности в 8 раз).

П р и м е р 5. Определение специфичности препарата.

Специфичность препарата определяли следующим образом:
После обработки сывороткой больного иммобилизированный гранулированный антигенный препарат обрабатывали иммунной флюоресцентной нормальной сывороткой, специфического свечения не отмечалось. После обработки препарата сывороткой донора с последующей обработкой сывороткой против иммуноглобулинов человека специфического свечения не отмечалось.

Иммобилизированный гранулированный антигенный материал обрабатывали сывороткой больного (заведомо положительной), а затем соответствующей кроличьей сывороткой против иммуноглобулинов человека, сывороткой не окрашенной ФИТЦ, после промывания препарата снова обрабатывали гомологичной, но уже флюоресцирующей антисывороткой, отмечали слабое специфическое свечение.

Нами введен дополнительный контрольный тест: заведомо положительную сыворотку адсорбировали антигеном сердца крысы, затем работу данной сыворотки проверяли на гранулах и срезах, специфического свечения нет.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике поражений сердца при ревматических и других заболеваниях иммунного генеза. Сущность изобретения состоит в том, что получают ультразвуковой дезинтеграт сердца белой крысы, концентрируют его и включают в трехмерную структуру полиакриламидного геля. Гранулы, содержащие дезинтеграт и магнитный материал, использовали для определения антикардиальных антител у больных ревматизмом. Предложенный способ позволяет получить положительные результаты в 100 % случаев и титры антител статистически достоверно более высокие, чем в традиционном методе на срезах. Использование предложенного способа дает возможность улучшить раннюю диагностику и назначить своевременное лечение.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКАРДИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ иммунофлуоресцентным методом путем обработки ткани сердечной мышцы, отличающийся тем, что обработку проводят методом ультразвуковой денентеграции, смесь концентрируют и вносят акриламид, метиленбисакриламид и магнитный материал в соотношении 3 : 1 : 2 соответственно.