СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/385 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в диагностических целях для выделения и изучения свойств синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa).

P.aeruginosa является возбудителем синегнойной инфекции у животных и человека, при этом заболевание может сопровождаться разнообразной симптоматикой в зависимости от места локализации патогена. Чаще всего в бактериологических лабораториях для первичного выделения синегнойной палочки используют мясо-пептонный агар (МПА). Между тем из патологического материала вместе с синегнойной палочкой, как правило, выделяются и другие бактерии, что затрудняет диагностику и способствует увеличению продолжительности проведения лабораторных исследований. Кроме того, на МПА синегнойная палочка не всегда реализует свои пигментообразующие свойства, которые являются важным таксономическим признаком при идентификации этого микроорганизма. P.aeruginosa может продуцировать разнообразные пигменты, такие как сине-зеленый (пиоцианин), красный (пиорубин), черный (меланин), желтый (α-оксифенозин), флюоресцин (пиовердин), синтез которых стимулируется при добавлении в питательные среды таких соединений, как глицерин, соли магния, калия и железа (Синегнойная инфекция. /Под ред. А.Ф.Мороз. - М.: Медицина, 1988).

В связи с этим для идентификации P.aeruginosa по пигментообразованию предложены среды Кинг А и Кинг В (Скородумов Д.И. с соавт. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных: - М.: ИзографЪ, 2005. - С.527). Первая включает в себя, г/л: пептон - 20, глицерин - 10, хлористый магний - 1,4, сернокислый калий - 10, агар - 15, дисциллированная вода - 1 л. Она используется для обнаружения пиоцианина. Вторая среда состоит из, г/л: пептона - 20, глицерина - 10, натрия фосфорнокислого двухзамещенного - 1,5, магния сернокислого - 1,5 и дисциллированной воды - 1 л. Она используется для обнаружения пиовердина. Однако данные среды не являются селективными, т.к. на них растут и другие микроорганизмы, поэтому они используются только при работе с чистыми культурами.

В настоящее время в ветеринарной и медицинской микробиологии для более быстрого выделения и дифференциации P.aeruginosa в патологическом материале используется селективная среда - ЦПХ-агар (Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие /Под ред. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной. - М.: Медицина, 2005. - С.576-577 - прототип). В состав данной среды входят, г/л: пептон - 20, калия сульфат - 7,6, магний сернокислый - 2,4, N-цитилперидиний хлорид - 0,3, каливая соль фенозана - 0,5, натрия карбонат - 1,0, агар - 10, вода дисциллированной - 1 л. ЦПХ-агар обеспечивает хороший селективный рост и пигментообразование P.aeruginosa. Между тем среда имеет ряд недостатков:

1. Готовая среда непрозрачна, что затрудняет изучение морфологии образовавшихся колоний.

2. На данной среде помимо синегнойной палочки могут вырастать и другие бактерии, в частности энтерококки, клебсиеллы, провиденсии.

3. Изоляты, образующие другие виды пигментов, кроме пиоцианина и флюоресцина, формируют на среде беспигментные или слабоокрашенные колонии.

4. Компоненты питательной среды - N-цитилперидиний хлорид и каливая соль фенозана дефицитны и дорогостоящи.

Техническим решением задачи является обеспечение доступности, повышение селективных и дифференцирующих свойств и прозрачности питательной среды.

Поставленная задача достигается тем, что способ приготовления питательной среды для выявления синегнойной палочки включает смешивание ферментативного пептона, глицерина, магния сернокислого, калия сернокислого, магния хлористого, агара, растворение в 0,5 л теплой дистиллированной воды и доведение затем объема до 1 литра, а затем нагрев смеси до кипения при следующем соотношении компонентов, г/л:

Ферментативный пептон - 18-22,0

Глицерин - 8-12,0

Магния сульфат - 0,9-1,1

Калия сульфат - 4-6,0

Магния хлорид - 0,4-0,6

Агар - 13-17,0

Дистиллированная вода - до 1 литра,

при этом после нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,2-7,4, фильтруют и вносят в среду 0,10-0,14 г фуразолидона, предварительно растворенного в 10-14 мл диметилсульфоксида, после охлаждения до 45-50°С среду взбалтывают и разливают в чашки Петри.

Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработана дифференциально-диагностическая среда, обладающая выраженными селективными свойствами по отношению к P.aeruginosa, на которой микроорганизм формирует пигментированные колонии. Селективные свойства среды обусловлены содержащимся в ее составе лекарственным препаратом фуразолидоном (N-(5-нитро-2-фурфурилиден)-3-аминоосазолидон-2), к которому синегнойная палочка устойчива, в то время как другие бактерии к этому веществу чувствительны. Стимуляция пигментообразования реализуется за счет глицерина, магния хлорида, магния сульфата и калия сульфата.

Способ приготовления питательной среды для выделения синегнойной палочки осуществляется следующим образом.

Первоначально сухие ингредиенты и глицерин растворяют в 0,5 л теплой дистиллированной воды, после чего доводят объем полученной смеси до 1 л, а затем нагревают до кипения, после расплавления агара устанавливают рН в пределах 7,2-7,4, фильтруют, добавляют фуразолидон, предварительно растворенный в 10-14 мл диметилсульфоксида (ДМСО, димексид), после охлаждения до 45-50°С среду взбалтывают и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачна, светло-желтого цвета.

На данной среде P.aeruginosa через 20-24 ч после посева материала образует характерные для данного микроорганизма колонии с заметным пигментообразованием. В зависимости от свойств конкретных штаммов колонии и среда окрашиваются от светло-зеленого до фиолетового цвета.

Результаты сравнительного анализа заявляемого способа и прототипа представлены в таблице, из которой видно, что заявляемая среда более выгодно отличается от прототипа, т.к. прозрачна, на ней синегнойная палочка в более ранние сроки дает видимый рост и пигментообразование, позволяет выявить беспигментные на ЦПХ-агаре варианты микроорганизма, полностью подавляет сопутствующие синегнойной палочке бактерии. Данные обстоятельства позволяют считать заявляемую питательную среду как патентоспособную.

Таблица Сравнительная характеристика заявляемой среды со средой ЦПХ-агар для выделения и идентификации синегнойной палочки Показатель Новая среда ЦПХ-агар (прототип) Физические свойства Плотная, прозрачная, светло-желтого цвета Плотная, непрозрачная, кремового цвета Начало появления видимого роста колоний и пигментообразования 9-10 ч 13-15 ч Максимальный рост колоний и пигментообразование 20-24 ч 36-48 ч Подавление сопутствующей микрофлоры Полностью подавляется Могут расти энтерококки, клебсиеллы, провиденсии Цветовая гамма продуцируемых синегнойной палочкой пигментов:
Штамм №61
Штамм №6665
Штамм №827
Штамм №1726
Штамм №1832 Синий
Темно-синий
Сине-зеленый
Желто-зеленый
Черный Желто-зеленый
Зеленый
Желтый
Беспигментный
Темно-серый

Пример конкретного осуществления приготовления среды: 20 г пептона, 10 г глицерина, 1 г магния сернокислого, 5 г калия сернокислого, 0,5 г магния хлористого, 15 г агара растворяют в 0,5 л теплой дистиллированной воды, доводят объем полученной смеси до 1 л и нагревают до кипения, после расплавления агара устанавливают рН в пределах 7,2-7,4, фильтруют, добавляют 0,12 г фуразолидона, предварительно растворенного в 10 мл ДМСО, после охлаждения до 45-50°С среду взбалтывают и разливают в чашки Петри.

Количественное значение ввода в среду магния сернокислого, калия сернокислого, магния хлористого и фуразолидона было подобрано экспериментально. При вводе магния сернокислого в количестве 0,5-0,8 г, калия сульфата - 2-3 г, магния хлорида - 0,1-0,3 г пигментообразование у выросших колоний P.aeruginosa слабое или полностью отсутствует. При увеличении количества ввода магния сульфата до 1,2-1,5, сульфата калия до 7-9 г, магния хлорида до 0,7-0,9 г наблюдается малая интенсивность роста колоний и слабо выраженное пигментообразование. При добавлении в среду фуразолидона в количестве 0,05-0,09 г снижается селективность среды, на ней могут расти протей, провиденсии, клебсиеллы, стрептококки. При добавлении фуразолидона в количестве 0,15-0,20 г тормозится рост самой синегнойной палочки.

Готовая для употребления (разлитая в чашки Петри) среда может храниться, без изменения своих свойств, в условиях холодильника в течение 10-15 дней.

Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации количественного ввода в среду магния сернокислого, калия сернокислого, магния хлористого и фуразолидона. На полученной среде штаммы P.aeruginosa дают видимый рост и пигментообразование уже через 9-10 ч инкубации при температуре 37°С. Среда не влияет на морфологию клеток и формируемых колоний. Окончательную оценку выросших колоний осуществляют через 20-24 ч.

Способ предусматривает смешивание, г/л: ферментативного пептона - 18,0-22,0, глицерина - 8,0-12,0, магния сернокислого - 0,9-1,1, калия сернокислого - 4,0-6,0, магния хлористого - 0,4-0,6, агара - 13,0-17,0 и дистиллированной воды - до 1 л. Нагревают полученную смесь до кипения и расплавления агара. Устанавливают рН 7,2-7,4. Фильтруют смесь. Навеску фуразолидона в количестве 0,10-0,14 г/л предварительно растворяют в 10 мл диметилсульфоксиде и вносят в среду. Охлаждают полученную питательную среду. Способ позволяет повысить селективные и дифференцирующие свойства и прозрачность питательной среды. 1 табл.

Способ приготовления питательной среды для выявления синегнойной палочки, включающий смешивание ферментативного пептона, глицерина, магния серно-кислого, калия серно-кислого, магния хлористого, агара, растворение их в дистиллированной воде при следующем соотношении компонентов, г/л:
Ферментативный пептон 18,0-22,0 Глицерин 8,0-12,0 Магний серно-кислый 0,9-1,1 Калий серно-кислый 4,0-6,0 Магний хлористый 0,4-0,6 Агар 13,0-17,0 Дистиллированная вода До 1 л

после нагревания смеси до кипения и расплавления агара устанавливают рН 7,2 -7,4, фильтруют смесь и вносят в среду 0,10-0,14 г фуразолидона, предварительно растворенного в 10-14 мл диметилсульфоксида, охлаждают питательную среду до 45-50°С.