Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K38/00 A61K39/385 C07K14/505 C12N15/62 A61P7/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области медицины и касается Fc-эритропоэтин слитого белка с улучшенной фармакокинетикой. Сущность изобретения включает новые сиалилированные Fc-EPO слитые белки, предпочтительно включающие пару модификаций в Fc-части, а также в ЕРО части, которые имеют улучшенную фармакокинетику. В частности, Fc-EPO белки обладают длительным периодом полураспада в сыворотке крови и повышенной эффективностью in vivo. Fc-EPO слитые белки, синтезированные в клетках ВНК, обладают значительно более продолжительными периодами полураспада в сыворотке крови и повышенной эффективностью in vivo по сравнению с соответствующими Fc-EPO слитыми белками, полученными в других линиях клеток, таких как, например, клетки NS/0. Преимущество изобретения заключается в улучшении фармакокинетических свойств эритропоэтина. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 табл., 11 ил.

1. Очищенный высоко сиалилированный димерный слитый белок, который существенно состоит из димерной Fc части, содержащей CH2 и CH3 домен IgG2 человека, шарнирный участок IgG человека, и человеческого эритропоэтина (ЕРО), где каждая цепь димерной Fc части является связанной посредством своего С-терминального конца непосредственно или с помощью линкерного пептида с N-терминальным концом молекулы ЕРО, при этом слитый белок обладает следующими свойствами:
(i) молекула ЕРО включает 15-28 остатков сиаловой кислоты;
(ii) участок Gln-Phe-Asn-Ser последовательности заменен Gln-Ala-Gln-Ser в пределах СН2 домена указанного IgG2, и
(iii) аминокислотная последовательность участка Leu-Ser-Leu-Ser вблизи С-терминального конца СН3 домена указанного IgG2 заменена Ala-Thr-Ala-Thr.

2. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором дополнительно C-терминальный остаток Lys СН3 домена заменен Ala.

3. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором шарнирный участок имеет происхождение от IgG1 человека.

4. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.3, в котором указанный шарнирный участок IgG1 является модифицированным путем замены аминокислотного остатка Cys в пределах последовательности Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys шарнирного участка остатком Ser, образуя, таким образом, последовательность Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys в пределах шарнирного участка.

5. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором эритропоэтиновая часть включает, по крайней мере, одну из следующих аминокислотных замен:
(i) остаток, отличный от цистеина, в положении 29 молекулы ЕРО,
(ii) остаток, отличный от цистеина, в положении 33 молекулы ЕРО,
(iii) остаток цистеина в положении 88 молекулы ЕРО и
(iv) остаток цистеина в положении 139 молекулы ЕРО.

6. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.5, в котором аминокислотный остаток, отличный от Cys, находится в положении 33 молекулы ЕРО вместо исходного остатка Cys, а остаток Cys находится в положении 88 молекулы ЕРО вместо исходного остатка Trp, что позволяет, таким образом, ЕРО части в пределах слитого белка образовывать Cys₂₉-Cys₈₈ дисульфидную связь.

7. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.6, в котором аминокислотный остаток, отличный от Cys, находящийся в положении 33, представляет собой Pro.

8. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором ЕРО часть включает одну или более мутаций, выбранных из группы:
(i) Arg₁₃₁→Glu₁₃₁
(ii) Arg₁₃₉→Glu₁₃₉
(iii) His₃₂→Gly₃₂
(iv) Ser₃₄→Arg₃₄
(v) Pro₉₀→Ala₉₀.

9. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором линкерный пептид включает сайт гликозилирования.

10. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.9, в котором сайт гликозилирования включает аминокислотную последовательность Asn-Ala-Thr.

11. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором полная молекула IgG, включая шарнирный участок, имеет происхождение от IgG2.

12. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, который дополнительно включает СН1 домен.

13. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором слитый белок содержит 20-22 остатка сиаловой кислоты.

14. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.1, включающий последовательность:
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLPPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTPRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSN
KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPE3STNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENI
TVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPL
QLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYS
NFLRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 14).

15. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.1, включающий последовательность:
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLPPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSN
KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITV
PDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLWSSQPCEALQL
HVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNF
LRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 15).

16. Молекула ДНК, кодирующая слитый белок по п.1.

17. Фармацевтическая композиция, приемлемая для лечения расстройств гематопоэза или гематопоэтической недостаточности у млекопитающего, включающая эффективное количество Fc-EPO слитого белка, охарактеризованного в п.1, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

18. Популяция очищенных высоко сиалилированных Fc-EPO слитых белков по п.1, приемлемых для введения млекопитающему, которую получают путем введения молекулы ДНК, кодирующей соответствующий Fc-EPO слитый белок, в клетку ВНК, экспрессии, изоляции и очистки популяции соответствующих Fc-EPO слитых белков, где указанная популяция имеет более длительный период полураспада в сыворотке крови по сравнению с популяцией соответствующих Fc-EPO слитых белков, синтезированных в клетках NS/0, PerC6 или 293.

19. Популяция очищенных Fc-EPO слитых белков по п.18, где указанная популяция слитых белков содержит в среднем 20-22 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.

20. Популяция очищенных Fc-EPO слитых белков по п.18 или 19, где ВНК клетка является адаптированной для роста в среде, не содержащей белка, или в суспензии.

21. Способ получения популяции высоко сиалилированных очищенных рекомбинантных Fc-EPO слитых белков по п.1, причем указанный способ включает следующие этапы:
(i) конструирование молекулы ДНК, кодирующей соответствующий Fc-EPO слитый белок;
(ii) трансформацию ВНК клетки с помощью указанной молекулы ДНК в среде, не содержащей белка, или в суспензии;
(iii) экспрессию популяции Fc-слитых белков, кодируемых указанной молекулой ДНК,
(iv) сбор, изоляцию и очистку указанной популяции Fc-EPO слитых белков.

22. Способ по п.21, в котором указанная синтезированная популяция слитых белков содержит в среднем 15-28 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.

23. Способ по п.21, в котором указанная синтезированная популяция слитых белков содержит в среднем 20-22 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.