СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЯМБЛИОЗНОЙ ИНВАЗИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике при постановке диагноза лямблиоза и оценке степени инвазированности организма данным паразитом.

Лямблиоз - (синоним - жиардизм) (возбудитель Lamblia intestinalis (Lamble, 1859) (синонимы, используемые в иностранной литературе - Giardia lamblia, G. intestinalis, G. duodenalis).

Одним из способов диагностики лямблиоза является исследование фекалий методом нативного мазка и микроскопическое исследование дуоденального содержимого (Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы). Руководство для врачей. - под ред. Сергеева В.П., Лобзина Ю.В., Козлова С.С. // Санкт-Петербург, «Фолиант», 2006, С.128-129.). Указанные способы лабораторной диагностики лямблиоза обладают недостаточной чувствительностью, так как не являются методами обогащения и не позволяют оценить количественно степень инвазии по количеству цист в исследуемом материале.

Наиболее близким к нашему изобретению является комбинированный метод исследования фекалий человека с целью выявления цист лямблий, использующий в качестве флотационной жидкости 33%-ный раствор сульфата цинка (ZNSO₄) (Генис Д.Е. Медицинская паразитология. - М., «Медицина», 1991, С.164).

Существенными недостатками этого метода являются низкая диагностическая эффективность и невозможность количественного учета полученных результатов.

Целью изобретения является улучшение диагностики лямблиоза, осуществление количественной оценки степени инвазии.

Способ осуществляется следующим образом: для приготовления флотационных смесей ингредиентами служат насыщенные водные растворы хлорида цинка (ZnCl₂, ρ-1,82), хлорида натрия (NaCl, ρ-1,19) и глицерин (Ч). Удельный вес приготовленных флотационных растворов определяют с помощью денсиметра при t 25 С°. Используется трехингредиентный флотационный раствор, состоящий из хлористого цинка, глицерина и хлористого натрия в соотношении 1:1:1 (объем / объем / объем).

Исследование фекалий: свежую пробу фекалий массой 1 грамм суспендируют в 10 мл воды, фильтруют через металлический фильтр с величиной пор 0,5×0,5 мм. Полученный фильтрат центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Затем полученный осадок суспендируют во флотационном растворе и центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Всплывающие цисты, концентрирующиеся в поверхностной пленке раствора, снимают при помощи стандартной металлической петли и подсчитывают их количество в объеме 0,2 мл флотационной жидкости без покровного стекла при окуляре с увеличением, кратным ×8, и объективе с увеличением, кратным ×20.

Степень инвазии оценивают как низкую при обнаружении 1-2 цисты или вегетативные формы в поле зрения (1 степень); средняя - при обнаружении до 5 цист или вегетативных форм в поле зрения (2 степень); высокая - до 10 (3 степень); очень высокая более 10 цист или вегетативных форм в поле зрения (4 степень).

Исследование дуоденального содержимого: пробу желчи порция А, В, С, (дуоденального содержимого) объемом в 1 мл суспендируют в 10 мл воды, фильтруют. Полученный фильтрат центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Полученный осадок суспендируют во флотационном растворе и центрифугируют при 1500 g в течение 5 мин. Всплывающие цисты, концентрирующиеся в поверхностной пленке раствора, снимают при помощи стандартной металлической петли и подсчитывают в объеме 0,2 мл флотационной жидкости без покровного стекла при окуляре с увеличением, кратным ×8, и объективе ×20.

Степень инвазии оценивают как низкую при обнаружении 1-2 цисты или вегетативные формы в поле зрения (1 степень); средняя - при обнаружении до 5 цист или вегетативных форм в поле зрения (2 степень); высокая - до 10 (3 степень); очень высокая более 10 цист или вегетативных форм в поле зрения (4 степень).

За счет использования комбинированного метода исследования фекалий с многокомпонентной флотационной системой удалось решить следующие задачи:

- увеличение времени кристаллизации (за счет глицерина), что позволяет при использовании насыщенных растворов увеличить время просмотра образцов;

- подбора оптимальной для выявления цист лямблий и самих вегетативных форм удельной плотности флотационной жидкости за счет хлористого цинка;

- уменьшением себестоимости анализа за счет использования хлористого натрия и глицерина.

Заявленный способ позволяет обеспечить повышение выявляемости цист Lamblia intestinalis в фекалиях и дуоденальном содержимом человека и количественно оценить степень инвазии.

В условиях клинической лаборатории поликлиники при ФГУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора нами при использовании этой методики удавалось обнаружить у 49% обследованных цисты или вегетативные формы лямблий. При параллельном исследовании общепринятым методом нативного мазка лямблиоз был диагностирован лишь у 39,7% обследованных. Следовательно, патентуемый нами копроскопический метод исследования фекалий позволил дополнительно выявить 9,3% лиц, инвазированных L. intestinalis. Это обусловлено использованием сочетания этапов седиментации и флотации в многокомпонентной флотационной системе, которая была положена в основу данного метода. Отдельно отметим, что компоненты предлагаемой нами флотационной системы не нарушают морфологию цист лямблий, не создают затруднений с морфологической идентификацией возбудителя и позволяют избирательно концентрировать цисты простейших. В предлагаемом методе в отличие от метода нативного мазка используется определенный объем каловых масс (1 г), что позволяет рассматривать его как полуколичественный. Таким образом, предлагаемый способ может использоваться в комплексной диагностике лямблиозной инвазии.

Пример (лабораторный номер - №46) Ребенок 7 лет, с неотягощенной наследственностью, от 1-й беременности. С 4 лет сочетанно с желудочно-кишечными симптомами заметили появление приступов учащенного дыхания, стойкую субфебрильную температуру тела. По направлению участкового педиатра обратились в консультативно-диагностическую аллергологическую поликлинику ФГУН КНИЭМ Роспотребнадзора. Врач аллерголог назначил ребенку следующее обследование: OAK, обзорную рентгенограмму органов грудной клетки, исследование кала на простейших и яйца гельминтов, уровень общего и специфического IgE. При исследовании крови была обнаружена гипохромная анемия. На рентгенограмме грудной клетки определялась небольшая инфильтрация в прикорневых зонах легких. В анализах крови -эозинофилия до 10% и увеличение СОЭ (до 25 мм / ч). Содержание сывороточного IgE - 0,17 г /л; IgM - 0,73 г /л; IgG - 5,07 г /л. Уровень циркулирующих иммунных комплексов до 45 единиц.

При исследовании методом нативного мазка пробы фекалий данного пациента эмульгировали в капле раствора Люголя на предметном стекле.

Нативный препарат рассматривали при окуляре с увеличением, кратным ×10, и объективе ×40. При этом цисты или вегетативные формы лямблий выявлены не были.

Далее был применен патентуемый нами метод. Пробу фекалий больного исследовали следующим образом: свежую пробу фекалий массой 1 грамм суспендировали в 10 мл воды, фильтровали через металлический фильтр с величиной пор 0,5×0,5 мм. Полученный фильтрат центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Затем полученный осадок суспендировали во флотационном растворе и центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Поверхностную пленку снимали при помощи стандартной металлической петли. Использовали окуляр с увеличением, кратным ×8, и объектив с увеличением, кратным ×20.

При помощи предлагаемого нами комбинированного метода исследования были выявлены 3-4 цисты Lamblia intestinalis в поле зрения (средняя степень инвазии), что было оценено врачом-лаборантом как лямблиоз кишечника, и проведена противопаразитарная терапия.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике при постановке диагноза лямблиоза и оценке степени инвазированности организма данным паразитом. Способ диагностики лямблиоза у человека осуществляется с помощью суспендирования во флотационном растворе исследуемого образца, центрифугирования, снятия поверхностной пленки с флотационного раствора и ее микроскопическое исследование. При этом центрифугируют при 1500 g в течение 5 минут. Для приготовления флотационных смесей ингредиентами служат насыщенные водные растворы хлорида цинка (ZnCL₂, ρ-1,82), хлорида натрия (NaCl, ρ-1,19) и глицерин в соотношении 1:1:1 (объем/ объем/ объем). Поверхностную пленку исследуют на наличие цист и/или вегетативных форм. Степень инвазии оценивают как низкую, среднюю, высокую и очень высокую. Изобретение позволяет улучшить диагностику лямблиоза и осуществить количественную оценку степени инвазии. При этом компоненты предлагаемой флотационной системы не нарушают морфологию цист лямблий и не создают затруднений с морфологической идентификацией возбудителя.

Способ диагностики лямблиоза у человека, включающий суспендирование пробы биологического экскрета в воде, центрифугирование, суспендирование полученного осадка во флотационном растворе, центрифугирование, снятие поверхностной пленки с поверхности флотационного раствора и ее микроскопическое исследование, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют при 1500g в течение 5 мин, используют трехингредиентную флотационную систему, для приготовления которой используют насыщенные водные растворы хлорида цинка (ZnCl₂) и натрия хлорида (NaCl), а также глицерин, в объемном соотношении 1:1:1, а поверхностную пленку исследуют на наличие цист и/или вегетативных форм лямблий и оценивают низкую степень инвазии при обнаружении 1-2 цисты или вегетативные формы; среднюю - при обнаружении до 5 цист или вегетативных форм в поле зрения; высокую - до 10; очень высокую - более 10 цист или вегетативных форм в поле зрения.