Способ диагностики лямблиоза Российский патент 2020 года по МПК A61B5/00 G01N33/569 G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, кожным болезням, патологической анатомии, и может быть использовано гастроэнтерологами, дерматологами и патологоанатомами для выявления лямблиоза.

Известны способы диагностики лямблиоза по обнаружению цист или трофозоитов в образцах фекалий или дуоденальном содержимом. Эффективность простой микроскопии кала составляет около 50% из-за характерной прерывистости в цистовыделении, связанной с особенностями размножения трофозоитов лямблий. Точность диагностики повышается при повторных исследованиях, поэтому многие авторы рекомендуют проводить обследование трехкратно. [«Клиника, диагностика и лечение лямблиоза у детей» Оригинальная статья. Е.А. Корниенко, С.Н. Минина, С.А. Фалина, Т.Б. Лобода. Журнал «Педиатрическая фармакология». 2009. Том 6, №4 стр. 40-46].

Недостатком этого способа является значительная трудность идентификации атипичных цист. Для более точной диагностики вышеуказанным методом многие авторы рекомендуют проводить обследование трехкратно, что увеличивает время постановки диагноза и начала адекватного лечения. Также перед исследованием на 5-7-й день желательно исключать медикаменты в связи с возможностью повреждения морфологии цист, что, в свою очередь, может негативно повлиять на общее состояние пациента.

Известен способ диагностики лямблиоза с помощью метода ПЦР (полимеразная цепная реакция), основанного на увеличении количество копий детектируемого участка генома (ДИК) искомого объекта в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. [Руководство по лабораторным методам диагностики. Д.м.н. проф. А.А. Кишкун. 2007 стр. 522].

Существенным недостатком ПЦР является то, что данный метод высокочувствительный и, соответственно возникает большая вероятность загрязнения (контаминирование) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, что приводит к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производятся смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР. В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения. Существуют так же ложноотрицательные результаты, связанные с снижением чувствительности ПЦР, в следствии ингибирования реакции компонентами биологических образцов (гемоглобин, гепарин). [Журнал «Вестник Казахского Национального Медицинского Университета» А.Ш. Орадова. 2013. Стр. 308].

Ближайшим к заявляемому является способ иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на обнаружении в крови антител, специфических к антигенам лямблий. В сыворотке крови опознаются антитела, которые вырабатываются иммунной системой в ответ на поражение организма этим паразитом. [Руководство по лабораторным методам диагностики. Д.м.н. проф. А.А. Кишкун. 2007. Стр. 513].

Недостатком способа, выбранного в качестве прототипа, является то, что чувствительность и специфичность этого способа варьируют в зависимости от состава и качества используемых диагностических наборов. В частности, существует проблема перекрестных реакций антигенов лямблий с другими паразитарными и соматическими антигенами, которые дают ложноположительные результаты.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности диагностики лямблиоза.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе диагностики лямблиоза, заключающемся в определении антигена лямблий, исследуют мазки кала с помощью специфического моноклонального антитела и при количестве антигена лямблий в количестве от 1 до 3 в поле зрения диагностируют лямблиоз со «слабоположительной реакцией», от 3 до 5 в поле зрения - с «положительной» и более 5 в поле зрения - с «резко положительной».

Возбудителем лямблиоза является Lamblia intestinalis (одноклеточные жгутиковые простейшие), имеющие две стадии развития: вегетативную и цистную. От больного ребенка в сутки с каловыми массами выделяется до 900 млн. цист возбудителя, в то время как заражающая доза составляет всего 8-10 цист. Таким образом, при обнаружении антигена лямблий в кале можно с высокой точностью определить наличие лямблиоза и, соответственно, степень остроты патологического процесса.

количестве антигена лямблий от 1 до 3 в поле зрения диагностируют лямблиоз со «слабоположительной реакцией», т.к. на данной стадии пациент практически не предъявляет жалоб. При эндоскопическом исследовании может отмечаться лишь незначительная гиперемия в слизистой оболочке желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки. Но уже на этом этапе начинается токсико-аллергическое воздействие на организм. При количестве антигена от 3 до 5 в поле зрения появляются более выраженные клинические симптомы (со стороны Ж.К.Т. - тошнота, рвота), нарастает токсико-аллергическое воздействие, сходное с проявлением пищевой аллергии, поэтому реакция оценивается как положительная. При количестве антигена более 5 в поле зрения отмечаются выраженные клинические симптомы, такие как дискинезия желчевыводящих путей, выраженными проявления аллергической реакции - кожный зуд, развитие дисбиоза в следствие усиления бродильных процессов, обусловленных нарушением активности ферментов. В этой стадии происходят морфологические изменения, такие как атрофия ворсинок, расширение и углубление крипт, диффузная инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами. Поэтому данная реакция оценивается как резко положительная.

Способ осуществляется следующим образом. Производится мазок кала, далее препарат фиксируется в ацетоне в течение 3-5 мин., затем промывается в фосфатном буфере 5 мин. Обрабатывается в 3% перекиси водорода в течение 15 мин., промывается в 2 порциях буферного раствора - по 5 мин. Первую порцию можно заменить дистиллированной водой.

Далее наносятся антитела и производится нагрев на водяной бане в термостате 45 мин. Через каждые 15 мин. производится проверка во избежание подсыхания препарата. После нагрева препарат выдерживается при комнатной температуре 10 мин. Далее производится промывка в буферном растворе двукратно по 5 мин.

Производится система детекции: биотин наносится на мазки и выдерживается 20 мин. при комнатной температуре с контролем во избежание подсыхания препарата. Промывка в буферном растворе двукратно по 5 мин. Наносится одна капля стрептовидина, выдерживается 30 мин. с контролем во избежание подсыхания препарата. Далее производится промывка в буферном растворе двукратно по 5 мин.

Наносится диаминобензидин на 1-2 мин. Далее промывка однократно в буферном растворе, затем в дистиллированной воде, окрашивание метиленовой синькой для достижения более выраженного контура искомого объекта, заключение в бальзам, микроскопия.

В рамках предложенного проекта используются Mouse monoclonal antibody (6231) to Giardia lamblia 65 KDa. Продукт реакции проявляется в виде стойкого окрашивания в коричневый цвет. Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводится при увеличении объектива ×400 в 10 полях зрения.

Пример 1, Пациент X., 3 г., Диагноз: псориаз неуточненный. На лечении в СПбГПМУ. находился с 28.12.2018 по 21.01.2019. При исследовании заявленным способом количество антигенов цист лямблий составило 1-2 в поле зрения. Подтверждено наличие лямблиоза со «слабо положительной реакцией».

На основании полученных данных пациент получил специфическое лечение, в результате которого отмечена положительная динамика основного заболевания, снижение симптомов и улучшение общего состояния. Ребенок выписан из лечебного учреждения.

Пример 2. Пациентка Г., 6 л. Диагноз: псориаз обыкновенный. На лечении в СПбГПМУ находилась с 29.01.2019 по 04.02.2019. При исследовании заявленным способом антигены лямблии не обнаружены.

Заявляемый способ является высокочувствительным, достоверным и точным. Он позволяет проводить оценку наличия лямблиоза, независимо от их типичности (строение, размеры), что, несомненно упрощает диагностику. Выполнение заявляемого способа дает возможность определить наличие данного заболевания, характер интенсивности патологического процесса, а также начать своевременную патогенетически обоснованную терапию.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, дерматологии, патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики лямблиоза. Проводят определение антигена лямблий. Исследуют мазки кала с помощью специфического моноклонального антитела. При количестве антигена лямблий в количестве от 1 до 3 в поле зрения диагностируют лямблиоз со «слабоположительной реакцией», от 3 до 5 в поле зрения - с «положительной» и более 5 в поле зрения - с «резко положительной». Способ обеспечивает повышение точности диагностики лямблиоза за счет определения антигена лямблий иммуногистохимическим методом, что позволяет с высокой точностью определить наличие лямблиоза и, соответственно, степень остроты патологического процесса. 2 пр.

Способ диагностики лямблиоза, заключающийся в определении антигена лямблий, отличающийся тем, что исследуют мазки кала с помощью специфического моноклонального антитела и при количестве антигена лямблий в количестве от 1 до 3 в поле зрения диагностируют лямблиоз со «слабоположительной реакцией», от 3 до 5 в поле зрения - с «положительной» и более 5 в поле зрения - с «резко положительной».