СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПАКЛИТАКСЕЛА ИЗ РАСТЕНИЙ РОДА Taxus Российский патент 2009 года по МПК C07D305/14 

Это изобретение относится главным образом к способам получения паклитаксела из растений, содержащих паклитаксел. Более конкретно, изобретение относится к способам экстракции паклитаксела из растений семейства Taxaceae, включающего такие растения рода Taxus, как Taxus media, которые включают ряд стадий колоночной хроматографии с последующей кристаллизацией паклитаксела.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Паклитаксел представляет собой соединение, обладающее противоопухолевой активностью, изначально полученное из коры дерева Taxus brevifolia (тиса тихоокеанского). В 1960-е годы Национальный институт рака начал изучение растительных экстрактов, проявляющих противораковую или противоопухолевую активность. Было обнаружено, что неочищенный экстракт коры Taxus brevifolia ингибирует рост ряда опухолей. В 1971 году паклитаксел был выделен и описан M.C. Wani et al. (J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, (1971)), который определил структуру паклитаксела с помощью химических способов и рентгеноструктурного кристаллографического анализа. В 1979 году Schiff с соавторами продемонстрировали новый механизм действия паклитаксела. Этот механизм включает связывание с микротрубочками и предотвращение их деполимеризации в условиях, при которых обычно происходит деполимеризация. В настоящее время паклитаксел применяют в лечении рака яичников, рака груди и немелкоклеточного рака легких.

Хотя паклитаксел является природным продуктом, изначально выделенным из коры тихоокеанского тиса (T. brevifolia), он также был найден и в других растениях семейства Taxaceae, в том числе T. canadensis и T. yunnanensis. Паклитаксел также присутствует в поверхностных частях и корнях других видов тиса, в том числе Тиса европейского (T. baccata), хвоя которого содержит паклитаксел и аналоги азиатских тисов (Т. wallichiana и T. chinensis), и тисовых деревьев, выращенных для декоративных целей. Было обнаружено, что следующие разновидности сортов тисовых деревьев также содержат паклитаксел: T.x media "Henryi", T.x media "Runyan", T. cuspidata, T.x media "Halloran", T.x media "Hatfield", T.x media "Hicksii", T.x media "Tauntonii", T.x media "Dark Green Spreader", T.x media "Wardii", T.x media "Brownii", T.x media "Densiformis", T.x media "Nigra", T.x cuspidata "Brevifolia" и T. cuspidata "Spreader".

Все эти виды содержат паклитаксел в очень ограниченных количествах. Например, кора деревьев T. brevifolia и Т. yunnanensis содержит около 0,02% паклитаксела, хвоя и корни кустарника T. media Hicksii содержат от примерно 0,005% до примерно 0,1% паклитаксела.

В связи с этим разработка эффективных способов экстракции паклитаксела высокой чистоты из растительного материала представляет большой интерес. Настоящее изобретение относится к способам экстракции паклитаксела высокой чистоты из растительного материала с помощью хроматографии с последующей кристаллизацией паклитаксела.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, объектом настоящего изобретения являются способы получения паклитаксела высокой чистоты из растений, содержащих паклитаксел. Эти способы обладают преимуществами обеспечения стабильности паклитаксела, возможности использования различных сортов тисовых растений или его частей независимо от содержания паклитаксела и возможность максимального извлечения паклитаксела, присутствующего в биомассе. Способы, описанные в настоящем изобретении, дают некоторые преимущества по сравнению с существующими способами. Например, известно, что паклитаксел может подвергаться таким реакциям деградации, как эпимеризация в положении 7, дезацетилирование в положении 10 и отщепление боковой цепи в положении 13. Эти реакции деградации, которые влияют как на качество, так и на выход выделенного паклитаксела, являются следствием нагревания, особенно в среде, содержащей большие количества спиртовых растворителей. В способах, описанных в настоящем изобретении, спирты используются в ограниченных количествах и в условиях разбавления и в основном во время процесса экстракции не используется нагревание. Таким образом, описанные здесь способы увеличивают стабильность паклитаксела.

Более того, в описанных здесь способах можно использовать различные типы частей растений в качестве исходного материала. Более конкретно, исходным материалом, используемым в настоящем изобретении, могут быть листья, стебли, ветви, кора, корни отдельно или их смеси из паклитакселсодержащего растения. Исходный материал может быть выбран независимо от соотношения частей растения, природы культурных тисовых растений и содержания паклитаксела. Способы настоящего изобретения обеспечивают процесс той же эффективности и стабильность и высокое качество паклитаксела. Также описанные здесь способы предусматривают высокие выходы паклитаксела.

Эти способы включают получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из растительного материала. Паклитаксел выделяют из экстракта паклитаксела с помощью систем колоночной хроматографии, где каждая система колоночной хроматографии содержит неподвижную фазу и элюирующий растворитель, и кристаллизации паклитаксела, содержащегося по меньшей мере в одной фракции, полученной на конечной хроматографической стадии. В некоторых вариантах осуществления паклитаксел кристаллизуют из всех фракций, полученных на конечной хроматографической стадии. Полученные в результате кристаллы паклитаксела могут быть высушены. Как описано выше, в качестве исходного растительного материала можно использовать различные биологические массы. Если в качестве биомассы используют растение Taxus media (тис средний) целиком, растительный материал обычно состоит примерно из 40-60 массовых процентов (масс./масс.) надземных частей и примерно 60-40 масс./масс. процентов корней. Кроме того, неподвижная фаза и элюирующий растворитель могут быть разными в различных системах.

В способах по настоящему изобретению паклитаксел экстрагируют из растительного материала для получения экстракта паклитаксела. Паклитаксел можно экстрагировать из растительного материала с использованием растворителя, такого как комбинация воды и органического растворителя. Системы колоночной хроматографии используют для выделения паклитаксела из экстракта паклитаксела, получая по меньшей мере одну фракцию, содержащую паклитаксел, после каждого хроматографического разделения и, необязательно, воздействуя на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления элюирующего растворителя. В тех случаях, когда после каждого разделения собирается более одной фракции, по меньшей мере несколько фракций, содержащих паклитаксел, можно объединить перед удалением элюирующего растворителя из этой комбинации. Кроме того, кристаллизация может происходить на протяжении 24-часового периода и при комнатной температуре. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу экстракции паклитаксела из Taxus media путем экстракции растительного материала водным раствором, содержащим от примерно 40 до примерно 60 объемных процентов (об./об.) ацетона при комнатной температуре.

В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения включают получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из растительного материала, а затем выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела с помощью первой системы колоночной хроматографии, включающей первую неподвижную фазу и первый элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. Паклитаксел затем выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью второй системы колоночной хроматографии, включающей вторую неподвижную фазу и второй элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. После этого паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью третьей системы колоночной хроматографии, содержащей третью неподвижную фазу и третий элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. Кроме того, паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью четвертой системы колоночной хроматографии, содержащей четвертую неподвижную фазу и четвертый элюирующий растворитель, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. Затем паклитаксел кристаллизуют из по меньшей мере одной фракции, используя растворитель для кристаллизации, с получением кристаллов паклитаксела.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают получение экстракта паклитаксела путем экстрагирования паклитаксела из растительного материала.

Паклитаксел затем выделяют из экстракта паклитаксела с помощью первой системы колоночной хроматографии, содержащей первую неподвижную фазу и первый элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и удаления первого элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции для получения первого остатка. После этого паклитаксел выделяют из первого остатка с помощью второй системы колоночной хроматографии, включающей вторую неподвижную фазу и второй элюирующий раствороитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из первого остатка, а затем удаление второго элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции, с получением второго остатка. После этого паклитаксел выделяют из второго остатка с помощью третьей системы колоночной хроматографии, включающей третью неподвижную фазу и третий элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из второго остатка, а затем удаление третьего элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции с получением третьего остатка. Паклитаксел затем выделяют из третьего остатка с помощью четвертой системы колоночной хроматографии, включающей четвертую неподвижную фазу и четвертный элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из третьего остатка, а затем удаление четвертого элюирующего растворителя из третьего остатка с получением четвертого остатка. Затем паклитаксел кристаллизуют из четвертого остатка с использованием растворителя для кристаллизации с получением кристаллов паклитаксела.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению включают получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным растворителем, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона при комнатной температуре, а затем получения экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из экстракта растительного материала. Паклитаксел затем выделяют из экстракта паклитаксела с использованием первой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий только дихлорметан или смесь дихлорметана и метанола, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. На по меньшей мере одну фракцию затем воздействуют пониженным давлением для удаления дихлорметана и/или метанола. Паклитаксел затем выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью второй системы колоночной хроматографии, включающей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и в качестве элюирующего растворителя, содержащей ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, а затем воздействуют пониженным давлением на по меньшей мере одну фракцию для удаления ацетона. После этого паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью третьей системы колоночной хроматографии, содержащей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий смесь н-гексана и ацетона, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, а затем воздействия на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления н-гексана и ацетона. Кроме того, паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью четвертой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, воздействия на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата. По меньшей мере одну фракцию кристаллизуют за 24-часовой период, используя смесь циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации, при комнатной температуре с получением кристаллов паклитаксела. После этого кристаллы паклитаксела сушат в вакууме в течение 48 часов.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным растворителем, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона, при комнатной температуре, а затем получением экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из экстракта растительного материала. Затем паклитаксел выделяют из экстракта паклитаксела с помощью первой хроматографической системы, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, а затем воздействием на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для получения остатка, а затем растворением этого остатка в ацетоне для получения композиции ацетонового остатка. Впоследствии паклитаксел выделяют из композции ацетонового остатка с помощью второй системы колоночной хроматографии, включающей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. На по меньшей мере одну фракцию воздействуют пониженным давлением для удаления ацетона. Затем паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью третьей системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий н-гексан и ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и воздействием на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления н-гексана и ацетона. Паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью четвертой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и воздействием на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата. По меньшей мере одну фракцию кристаллизуют за 24-часовой период, используя смесь циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации, при комнатной температуре с получением кристаллов паклитаксела. Кристаллы паклитаксела сушат в вакууме в течение 48 часов.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным раствором, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона при комнатной температуре и получением экстракта паклитаксела экстракцией паклитаксела из экстракта растительного материала. Паклитаксел выделяют из экстракта паклитаксела с использованием первой хроматографической системы, включающей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и воздействием на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления дихлорметана и метанола. Паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью второй системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, воздействия на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением с получением остатка и растворением этого остатка в ацетоне с получением композиции ацетонового остатка. После этого паклитаксел выделяют из композиции ацетонового остатка с помощью третьей системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий н-гексан и ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и воздействием на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления смеси н-гексана и ацетона. Впоследствии паклитаксел выделяют из по меньшей мере одной фракции с помощью четвертой системы колоночной хроматографии, содержащей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и воздействуя на по меньшей мере одну фракцию пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата. После этого по меньшей мере одну фракцию кристаллизуют за 24-часовой период с использованием смеси циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации при комнатной температуре с получением кристаллов паклитаксела. Кристаллы паклитаксела сушат в вакууме в течение 48 часов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На чертеже показана схема последовательности операций, кратко описывающая осуществление способов по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы по настоящему изобретению включают способ получения паклитаксела из растений, содержащих паклитаксел. На чертеже показана схема последовательности операций, кратко описывающая стадии осуществления способов по настоящему изобретению. Стадия А включает получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из растительного материала, содержащего паклитаксел. Затем паклитаксел отделяют от других компонентов экстракта паклитаксела на стадиях B-E с использованием разделительных систем колоночной хроматографии. Каждая стадия, обозначенная (i), включает выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела или хроматографической фракции с помощью системы колоночной хроматографии, включающей неподвижную фазу и элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. Каждая стадия, обозначенная (ii), включает удаление элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции, полученной на предыдущей хроматографической стадии. В предпочтительном варианте осуществления на по меньшей мере одну фракцию воздействуют пониженным давлением для удаления элюирующего растворителя. Обозначения (a) и (b) на чертеже показывают альтернативные пути выделения. Например, если путь (a) применяют для каждой стадии выделения, то элюирующий растворитель не удаляют из по меньшей мере одной фракции паклитаксела. Напротив, если путь (b) используют для каждой стадии выделения, то элюирующий растворитель удаляют из по меньшей мере одной фракции паклитаксела. В некоторых вариантах осуществления путь (a) можно проводить для определенных стадий выделения, а путь (b) можно проводить для других стадий выделения. Например, на стадии B можно пойти по пути (b) так, что элюирующий растворитель удаляют из фракции, полученной на стадии B, тогда как на стадии C идут путем (a) так, что эту фракцию непосредственно выделяют на стадии D без удаления элюирующего растворителя стадии C. Стадия F включает кристаллизацию по меньшей мере одной фракции, полученной на конечной хроматографической стадии. В особом варианте осуществления по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии Е(ii), кристаллизуют на стадии F. Хотя на чертеже показаны только четыре хроматографические стадии, до кристаллизации могут иметь место дополнительные хроматографические стадии. После стадии кристаллизации может следовать стадия высушивания.

Растительный материал

Исходным материалом для использования на стадии А настоящего изобретения является растительный материал, содержащий паклитаксел. Подходящий растительный материал может быть получен из частей растения семейства Taxaceae, например растения Taxus. Предпочтительно, растительный материал получают из Taxus media. Подходящие сорта Taxus media включают T.x media "Hill", T.x media "Henryi", T.x media "Runyan", T. cuspidata, T.x media "Halloran", T.x media "Hatfield", T.x media "Hicksii", T.x media "Tauntonii", T.x media "Dark Green Spreader", T.x media "Wardii", T.x media "Brownii", T.x media "Densiformis", T.x media "Nigra", T.x cuspidata "Brevifolia" и T.x cuspidata "Spreader". Дополнительно растительный материал может быть получен из таких различных частей растения Taxus, как свежие или сушеные корни, листья, ветви, семена, кора, стебли, или их смесей. Предпочтительно, растительный материал получают примерно из 40-60 масс./масс. процентов наземных частей и примерно из 60-40 масс./масс. процентов корней. Растительный материал получают из частей растения, содержащих паклитаксел, например, путем экстракции, размельчения или разрезания. В особом варианте осуществления экстрагируемый растительный материал измельчают с использованием линии лопастных измельчителей, снабженный, например, сетью диаметром 10 мм. В одном варианте осуществления растительный материал экстрагируют по меньшей мере одним экстракционным растворителем. Подходящие растворители включают такие водные растворители, как водные органические растворители, например ацетон в воде. Предпочтительно, используют смесь примерно 40-60 объемных процентов ацетона и примерно 60-40 объемных процентов воды. Водный ацетон может предотвратить разрушение паклитаксела. Предпочтительно, экстракцию проводят при комнатной температуре. Экстракция при комнатной температуре может предотвратить разрушение паклитаксела.

Экстракция паклитаксела и близкородственных соединений

Перед первой стадией хроматографии, например перед стадией B, экстракт паклитаксела готовят как на стадии A. В одном варианте осуществления экстракт паклитаксела готовят путем экстракции паклитаксела из растительного материала с использованием растворителя. В особом варианте осуществления экстракт паклитаксела готовят обработкой водно-ацетонового экстракта растительного материала. Подходящие экстрагирующие растворители включают без ограничения такие алифатические сложные эфиры, как этилацетат, или такие хлорированные растворители, как хлороформ или дихлорметан. Предпочтительным экстрагирующим растворителем является дихлорметан. В особом варианте осуществления перед экстракцией паклитаксела одним из указанных выше растворителей водно-ацетоновый экстракт концентрируют в вакууме для удаления ацетона. Затем концентрат можно разбавить растворителем. Этот разбавляющий растворитель может включать метиловый спирт или такие другие водорастворимые спиртовые растворители, как этиловый или пропиловый спирт. Затем паклитаксел экстрагируют из разбавленного концентрата с использованием такого экстракционного растворителя, как дихлорметан, и других экстракционных растворителей, описанных выше. Образуется экстракт паклитаксела.

В одном варианте осуществления экстракт паклитаксела концентрируют в вакууме для удаления растворителей. Концентрированный экстракт паклитаксела содержит паклитаксел и его близкородственные соединения, хлорофиллы, жиры, лиганды, флаваноиды, фенолы и различные полярные примеси. Близкородственные соединения включают, например, цефаломаннин, N-дебезоил-N-гексаноил-паклитаксел, N-дебензоил-N-гексаноил-N-метил-паклитаксел, N-дебензоил-N-фенилацетил-паклитаксел, N-дебензоил-N-циннамоил-паклитаксел и 2-дебензоил-2-тиглоил-паклитаксел. Каждый из них может сопровождаться соответствующими 7-эпи-, 10-дезацетил- и 7-0-хсилозилпроизводными. Соответствующие последние производные паклитаксела также присутствуют. Эти непаклитакселовые компоненты и примеси можно удалить, используя хроматографические методики, описанные выше.

Хроматографическая очистка паклитаксела

Паклитаксел выделяют из экстракта паклитаксела, используя по меньшей мере 4-стадийную колоночную хроматографию, указанную на чертеже как стадии В-Е. Каждые стадии В(i)-E(i) включают использование хроматографической системы, включающей неподвижную фазу и элюирующий растворитель. Каждая система может представлять собой одинаковые аппараты с различной неподвижной фазой и различным элюирующим растворителем. Подходящие неподвижные фазы включают без ограничения нейтральную окись алюминия и силикагель. Возможные элюирующие растворители включают без ограничения ацетон, дихлорметан, метанол, н-гексан, трет-бутилацетат, хлороформ и этилацетат.

Каждая стадия хроматографии включает использование системы колоночной хроматографии, включающей неподвижную фазу и элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. По меньшей мере одна фракция может включать комбинацию множества фракций, полученных на стадии хроматографии. Например, на стадии хроматографии можно получить более одной фракции. Затем эти фракции объединяют и следующую стадию хроматографии выполняют на объединенных фракциях.

В соответствии с одним вариантом осуществления из по меньшей мере одной фракции удаляют элюирующий растворитель. На стадиях В(ii)-E(ii) на по меньшей мере одну фракцию можно воздействовать пониженным давлением для удаления элюирующего растворителя. Удаление растворителя из по меньшей мере одной фракции может включать удаление только части растворителя или необязательно всего растворителя.

В соответствии с одним вариантом осуществления на первой стадии хроматографии, стадии В(i), от паклитаксела отделяют в основном жиры, хлорофиллы, фенолы с низкой молекулярной массой и сильно полярные примеси. На второй стадии хроматографии, стадии С(i), от паклитаксела отделяют в основном дополнительные примеси, в особенности флавоноиды и лиганды. На третьей стадии хроматографии, стадии D(i), от паклитаксела отделяют в основном таксаны. Такие таксаны включают указанные выше производные таксана, в особенности цефаломаннин и следовые количества таких других таксанов, как указано выше. На четвертой стадии хроматографии, стадии Е(i), от паклитаксела отделяют в основном родственные цефаломаннину соединения. Подходящие для удаления цефаломаннина неподвижные фазы включают силикагель. Примеры пригодных элюирующих растворителей включают трет-бутилацетат, изобутилацетат, н-бутилформиат, изобутилформиат, трет-бутилформиат и втор-бутилформиат. Смотрите патент США 6333419, который включен сюда в качестве ссылки.

В соответствии с одним вариантом осуществления первая система колоночной хроматографии включает неподвижную фазу, включающую силикагель и элюирующий растворитель, содержащий метиленхлорид, с последующей смесью метиленхлорид-метанол в соотношении 99:1 об./об. или 98:2 об./об. В соответствии с другим вариантом осуществления вторая система колоночной хроматографии включает неподвижную фазу, содержащую нейтральную окись алюминия и элюирующий растворитель, содержащий ацетон. В соответствии с еще одним вариантом осуществления третья система колоночной хроматографии включает неподвижную фазу, содержащую силикагель и элюирующий растворитель, содержащий н-гексан и ацетон в соотношении 4:1 об./об. В соответствии с другим вариантом осуществления четвертая система колоночной хроматографии включает неподвижную фазу, содержащую силикагель, и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат.

Необязательно возможно также удаление примесей другим путем. Например, удаление фенолов с помощью окиси алюминия можно осуществлять до удаления хлорофиллов и жиров, используя силикагель в качестве неподвижной фазы.

Кристаллизация паклитаксела

Для получения кристаллов паклитаксела после финальной стадии хроматографии по меньшей мере одну содержащую паклитаксел фракцию, полученную на этой стадии, подвергают кристаллизации на стадии F, используя для кристаллизации растворитель. Подходящие для кристаллизации растворители включают циклогексан, ацетон, н-гексан, изогексан, н-гептан, трет-бутилацетат и их смеси. Преимущественно используют смесь циклогексана и ацетона в соотношении 1:1. В соответствии с одним воплощением изобретения кристаллизацию проводят при комнатной температуре. В основном кристаллизацию ведут на протяжении 24 часов. Однако кристаллизацию можно также проводить и в течение другого периода. Затем после кристаллизации кристаллы паклитаксела сушат в вакууме при температуре от примерно 50°C до примерно 60°C. Преимущественно кристаллы сушат примерно 48 часов.

ПРИМЕР 1

Одну тонну высушенного и измельченного растительного материала, полученного из T. media Hicksii, состоящего примерно из 500 кг корней и примерно 500 кг листьев и веток, экстрагируют при комнатной температуре 15000 л 50% водного ацетона. Экстракт концентрируют в вакууме до примерно 300 л. Затем добавляют 150 л метанола и проводят пять экстракций 200 л дихлорметана. Объединенные органические слои концентрируют в вакууме до получения мягкого осадка, который повторно растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке со 180 кг силикагеля. Через колонку элюируют около 2700 л дихлорметана и отбрасывают.

Затем элюируют паклитаксел смесью дихлорметан-метанол 99:1 (об./об.). Затем раствор выпаривают в вакууме до получения мягкого остатка. Остаток растворяют в 8 л ацетона с получением ацетонового остатка, который пропускают через колонку, содержащую 30 кг нейтральной окиси алюминия, элюируя тем же растворителем. Фракции, содержащие паклитаксел, объединяют и концентрируют в вакууме до 8 л.

Затем ацетоновый раствор помещают в колонку, содержащую 180 кг силикагеля, заполненную смесью н-гексан-ацетон 4:1. Элюирование этим же элюентом позволяет получить паклитаксел, свободный от большинства других таксанов за исключением цефаломаннина. Фракции, содержащие паклитаксел, объединяют и концентрируют в вакууме до 5 л.

Затем раствор хроматографируют, используя 180 кг силикагеля, заполненного трет-бутилацетатом, проводя элюирование этим же растворителем. Содержащие паклитаксел фракции объединяют и выпаривают в вакууме до получения мягкого остатка. При дополнительном элюировании колонок трет-бутилацетатом удаляли по меньшей мере цефаломаннин. Мягкий остаток (около 300 г), содержащий паклитаксел, растворяют в 2 л ацетона, разбавляют 1,2 л циклогексана и оставляют для кристаллизации. После фильтрования и сушки при 50°C в течение 48 часов получают 255 г паклитаксела, имеющего чистоту более 99%.

ПРИМЕР 2

Сто килограмм высушенного и измельченного растительного материала из целого Taxus media dark green spreader, состоящего примерно из 40 кг корней и примерно 60 кг листьев и веток, экстрагируют при комнатной температуре 1500 л 50% водного ацетона. Экстракт концентрируют в вакууме до 30 л. Затем добавляют 15 л метанола и проводят пять экстракций 20 л дихлорметана. Дихлорметановые экстракты объединяют и концентрируют в вакууме до 15 л.

Добавляют метанол (150 мл) и раствор пропускают через колонку, содержащую 13 кг нейтральной окиси алюминия, элюируя дихлорметаном-метанолом 99:1 об./об. Содержащие паклитаксел фракции собирают и концентрируют в вакууме до 5 л.

Концентрированным раствором заполняют колонку, содержащую 9 кг силикагеля, и элюируют дихлорметаном-метанолом 99:1 об./об. После элюирования полярных примесей собирают 220 л фракций, содержащих паклитаксел, объединяют и выпаривают в вакууме до получения мягкого остатка (190 г).

Остаток растворяют в 400 мл ацетона до получения ацетонового остатка, который хроматографируют на колонке с 9 кг силикагеля, элюируя н-гексаном-ацетоном 4:1. Содержащие паклитаксел фракции собирают и еще раз очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя трет-бутилацетатом, как описано в примере 2. После кристаллизации из смеси циклогексан-ацетон 1:1 и сушки при 55°C получают 18,5 г паклитаксела, имеющего чистоту более 99%.

Изобретение относится к новым способам получения паклитаксела из растений, содержащих паклитаксел. Сначала получают растительный материал из растений, содержащих паклитаксел. Затем паклитаксел экстрагируют из растительного материала. Впоследствии паклитаксел выделяют из экстракта паклитаксела с использованием ряда стадий колоночной хроматографии для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел. Паклитаксел, находящийся во фракции, полученной на конечной стадии хроматографии, кристаллизуют. С использованием этих способов паклитаксел высокой чистоты может быть эффективно получен из различных сортов тисовых растений или его частей, содержащих паклитаксел независимо от содержания паклитаксела. 5 н. и 42 з.п. ф-лы., 1 ил.

1. Способ получения паклитаксела из растений, содержащих паклитаксел, включающий:
(a) получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из растительного материала;
(b) выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела с помощью первой системы колоночной хроматографии, включающей первую неподвижную фазу и первый элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел;
(c) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (b), с использованием второй системы колоночной хроматографии, включающей вторую неподвижную фазу и второй элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел;
(d) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (c), с использованием третьей системы колоночной хроматографии, включающей третью неподвижную фазу и третий элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел;
(e) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (d), с использованием четвертой системы колоночной хроматографии, включающей четвертую неподвижную фазу и четвертый элюирующий растворитель, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел; и
(f) кристаллизацию паклитаксела, содержащегося в по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (e), с использованием растворителя для кристаллизации, с получением кристаллов паклитаксела.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий высушивание кристаллов паклитаксела, полученных на стадии (f).

3. Способ по п.1, где растительный материал получен из частей растений.

4. Способ по п.3, где экстракт растительного материала получают путем экстракции растительного материала, содержащего от примерно 40 до примерно 60 мас./мас. процентов наземных частей и от примерно 60 до примерно 40 мас./мас. процентов корней.

5. Способ по п.1, где растительный материал содержит растительный материал, полученный из Taxus media, T.x media "Henryi", T.x media "Runyan", T. cuspidata, T.x media "Halloran", T.x media "Hatfield", T.x media "Hicksii", T.x media "Tauntonh", T.x media "Dark Green Spreader", T.x media "Wardii", T.x media "Brownii", T.x media "Densiformis", T.x media "Nigra", T.x cuspidata "Brevifolia" или Т. cuspidata "Spreader".

6. Способ по п.1, где вторая неподвижная фаза содержит нейтральную окись алюминия.

7. Способ по п.1, где первая, третья или четвертая неподвижная фаза содержит силикагель.

8. Способ по п.1, где первый, второй или третий элюирующий растворитель содержит ацетон, дихлорметан, метанол, н-гексан, трет-бутилацетат, хлороформ или этилацетат.

9. Способ по п.1, где первый элюирующий растворитель содержит дихлорметан и метанол.

10. Способ по п.1, где второй элюирующий растворитель содержит ацетон.

11. Способ по п.1, где третий элюирующий растворитель содержит н-гексан и ацетон.

12. Способ по п.1, где четвертый элюирующий растворитель содержит трет-бутилацетат, изобутилацетат, н-бутилформиат, изобутилформиат, трет-бутилформиат или втор-бутилформиат.

13. Способ по п.1, где растворитель для кристаллизации содержит циклогексан и ацетон.

14. Способ получения паклитаксела из растений, содержащих паклитаксел, включающий:
(a) получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из растительного материала;
(b) выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела, включающее:
(i) использование первой системы колоночной хроматографии, включающей первую неподвижную фазу и первый элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) удаление первого элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (b)(i), с получением первого остатка;
(c) выделение паклитаксела из первого остатка, полученного на стадии (b)(ii), включающее:
(i) использование второй системы колоночной хроматографии, включающей вторую неподвижную фазу и второй элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из первого остатка, и
(ii) удаление второго элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (c)(i), с получением второго остатка;
(d) выделение паклитаксела из второго остатка, полученного на стадии (c)(ii), включающее:
(i) использование третьей системы колоночной хроматографии, включающей третью неподвижную фазу и третий элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из второго остатка, и
(ii) удаление третьего элюирующего растворителя из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (d)(i), с получением третьего остатка;
(e) выделение паклитаксела из третьего остатка, полученного на стадии (d)(ii), включающее:
(i) использование четвертой системы колоночной хроматографии, включающей четвертую неподвижную фазу и четвертый элюирующий растворитель, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, из третьего остатка, и (ii) удаление четвертого элюирующего растворителя из третьего остатка, полученного на стадии (e)(i), с получением четвертого остатка; и
(f) кристаллизацию паклитаксела из четвертого остатка, полученного на стадии (e)(ii), с использованием растворителя для кристаллизации, с получением кристаллов паклитаксела.

15. Способ по п.14, где на стадии (е) из третьего остатка удаляют по меньшей мере цефаломаннин.

16. Способ по п.14, где первый элюирующий растворитель удаляют путем воздействия на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (b)(i), пониженным давлением.

17. Способ по п.14, где второй элюирующий растворитель удаляют путем воздействия на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (c)(i), пониженным давлением.

18. Способ по п.14, где третий элюирующий растворитель удаляют путем воздействия на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (d)(i), пониженным давлением.

19. Способ по п.14, где четвертый элюирующий растворитель удаляют путем воздействия на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (e)(i), пониженным давлением.

20. Способ по п.14, дополнительно включающий высушивание кристаллов паклитаксела, полученных на стадии (f).

21. Способ по п.20, где кристаллы паклитаксела сушат в вакууме.

22. Способ по п.14, где паклитаксел экстрагируют из растительного материала с использованием первого водного растворителя.

23. Способ по п.22, где первый водный растворитель содержит воду и ацетон.

24. Способ по п.14, где стадия (a) протекает при комнатной температуре.

25. Способ по п.14, где более одной фракции получают на стадии (b)(i) и по меньшей мере некоторые из фракций объединяют перед удалением первого элюирующего растворителя на стадии (b)(ii).

26. Способ по п.14, где более одной фракции получают на стадии (c)(i) и по меньшей мере некоторые из фракций объединяют перед удалением второго элюирующего растворителя на стадии (c)(ii).

27. Способ по п.14, где более одной фракции получают на стадии (d)(i) и по меньшей мере некоторые из фракций объединяют перед удалением третьего элюирующего растворителя на стадии (d)(ii),

28. Способ по п.14, где более одной фракции получают на стадии (e)(i) и по меньшей мере некоторые из фракций объединяют перед удалением четвертого элюирующего растворителя на стадии (е)(ii).

29. Способ по п.14, где кристаллизация стадии (f) происходит на протяжении 24-часового периода.

30. Способ по п.14, где кристаллизация стадии (f) происходит при комнатной температуре.

31. Способ по п.14, где растительный материал получают из частей растения.

32. Способ по п.31, где экстракт растительного материала получают путем экстракции растительного материала из частей растения, содержащих от примерно 40 до примерно 60 мас./мас. процентов наземных частей и от примерно 60 до примерно 40 мас./мас. процентов корней.

33. Способ по п.14, где растительный материал содержит растительный материал, полученный из Taxus media, T.x media "Henryi", T.x media "Runyan", T. cuspidata, T.x media "Halloran", T.x media "Hatfield", T.x media "Hicksii", T.x media "Tauntonii", T.x media "Dark Green Spreader", T.x media "Wardii", T.x media "Brownii", T.x media "Densiformis", T.x media "Nigra", T.x cuspidata "Brevifolia" или Т. cuspidata "Spreader".

34. Способ по п.14, где вторая неподвижная фаза содержит нейтральную окись алюминия.

35. Способ по п.14, где первая, третья или четвертая неподвижная фаза содержит силикагель.

36. Способ по п.14, где первый, второй или третий элюирующий растворитель содержит ацетон, дихлорметан, метанол, н-гексан, трет-бутилацетат, хлороформ или этилацетат.

37. Способ по п.14, где первый элюирующий растворитель содержит дихлорметан и метанол.

38. Способ по п.14, где второй элюирующий растворитель содержит ацетон.

39. Способ по п.14, где третий элюирующий растворитель содержит н-гексан и ацетон.

40. Способ по п.14, где четвертый элюирующий растворитель содержит трет-бутилацетат, изобутилацетат, н-бутилформиат, изобутилформиат, трет-бутилформиат или втор-бутилформиат.

41. Способ по п.14, где растворитель для кристаллизации содержит циклогексан и ацетон.

42. Способ получения паклитаксела из Taxus media, включающий:
(a) получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным растворителем, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона при комнатной температуре;
(b) получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из экстракта растительного материала, полученного на стадии (a);
(c) выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела, включающее:
(i) использование первой хроматографической системы, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий только дихлорметан или смесь дихлорметана и метанола, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (c)(i), пониженным давлением для удаления дихлорметана и/или метанола;
(d) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (c)(ii), включающее:
(i) использование второй системы колоночной хроматографии, включающей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (d)(i), пониженным давлением для удаления ацетона;
(e) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (d)(ii), включающее:
(i) использование третьей системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий смесь н-гексана и ацетона, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (e)(i), пониженным давлением для удаления н-гексана и ацетона;
(f) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (e)(ii), включающее:
(i) использование четвертой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (f)(i), пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата;
(g) кристаллизацию по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (f)(ii), на протяжении 24-часового периода с использованием смеси циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации, при комнатной температуре, с получением кристаллов паклитаксела; и
(h) высушивание кристаллов паклитаксела, полученных на стадии (g), в вакууме в течение 48 часов.

43. Способ по п.42, где получение экстракта паклитаксела на стадии (b) дополнительно включает:
(a) концентрированно экстракта растительного материала при пониженном давлении для удаления ацетона с получением концентрата;
(b) разбавление концентрата метиловым спиртом;
(c) экстракцию концентрата дихлорметаном с получением дихлорметанового экстракта;
и
(d) концентрацию дихлорметанового экстракта при пониженном давлении с получением экстракта паклитаксела.

44. Способ получения паклитаксела из Taxus media, включающий:
(a) получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным растворителем, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона, при комнатной температуре;
(b) получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из экстракта растительного материала, полученного на стадии (а);
(c) выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела, включающее:
(i) использование первой хроматографической системы, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел,
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (c)(i), пониженным давлением с получением остатка, и
(iii) растворение остатка, полученного на стадии (c)(ii), в ацетоне с получением смеси остатка с ацетоном;
(d) выделение паклитаксела из смеси остатка с ацетоном, полученной на стадии (c)(iii), включающее:
(i) использование второй системы колоночной хроматографии, включающей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (d)(i), пониженным давлением для удаления ацетона;
(e) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (d)(ii), включающее:
(i) использование третьей системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий н-гексан и ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (e)(i), пониженным давлением для удаления н-гексана и ацетона;
(f) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (e)(ii), включающее:
(i) использование четвертой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (f)(i), пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата;
(g) кристаллизацию по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (f)(ii), на протяжении 24-часового периода с использованием смеси циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации, при комнатной температуре, с получением кристаллов паклитаксела; и
(h) высушивание кристаллов паклитаксела, полученных на стадии (g), в вакууме в течение 48 часов.

45. Способ по п.44, где Taxus media включает Т. media Hicksii.

46. Способ получения паклитаксела из Taxus media, включающий:
(a) получение экстракта растительного материала из Taxus media путем экстракции растительного материала водным раствором, содержащим от примерно 40 до примерно 60 об./об. процентов ацетона, при комнатной температуре;
(b) получение экстракта паклитаксела путем экстракции паклитаксела из экстракта растительного материала, полученного на стадии (a);
(c) выделение паклитаксела из экстракта паклитаксела, включающее:
(i) использование первой хроматографической системы, содержащей нейтральную окись алюминия в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (c)(i), пониженным давлением для удаления дихлорметана и метанола;
(d) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (c)(ii), включающее:
(i) использование второй системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий дихлорметан и метанол, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел,
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (d)(i), пониженным давлением с получением остатка, и
(iii) растворение остатка, полученного на стадии (d)(ii), в ацетоне, с получением смеси остатка с ацетоном;
(e) выделение паклитаксела из смеси остатка с ацетоном, полученной на стадии (d)(iii), включающее:
(i) использование третьей системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий н-гексан и ацетон, для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (e)(i), пониженным давлением для удаления смеси н-гексана и ацетона;
(f) выделение паклитаксела из по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии
(e)(ii), включающее:
(i) использование четвертой системы колоночной хроматографии, включающей силикагель в качестве неподвижной фазы и элюирующий растворитель, содержащий трет-бутилацетат, для удаления по меньшей мере цефаломаннина и для получения по меньшей мере одной фракции, содержащей паклитаксел, и
(ii) воздействие на по меньшей мере одну фракцию, полученную на стадии (f)(i), пониженным давлением для удаления трет-бутилацетата;
(g) кристаллизацию по меньшей мере одной фракции, полученной на стадии (f)(ii), на протяжении 24-часового периода с использованием смеси циклогексана и ацетона в качестве растворителя для кристаллизации, при комнатной температуре, с получением кристаллов паклитаксела; и
(h) высушивание кристаллов паклитаксела, полученных на стадии (g), в вакууме в течение 48 ч.

47. Способ по п.46, где Taxus media включает Т. media "dark green spreader".