СПОСОБ ИНДУКЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У ПТИЦ Российский патент 2009 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно - к птицеводству.

Известны разные способы индукции иммунологической толерантности, то есть специфической терпимости к несовместимым донорским гистоантигенам у птиц, в частности - путем введения донорских органов и тканей эмбрионам или проведения взаимных трансплантаций крупного лоскута донорской кожи между молодняком суточного возраста (Гашек, М. Модификация иммунных реакций у эмбрионов и новорожденных животных / М.Гашек // Успехи совр. биол. - 1959. - Т.11, №3. - С.88-101). Недостаток этих способов состоит в том, что они недостаточно технологичны, поскольку введение донорских органов и тканей в инкубируемые яйца технически трудно выполнимо и приводит к гибели большинства эмбрионов, а операция трансплантации крупного лоскута кожи у молодняка птиц суточного возраста слишком травматична для партнеров и приводит к снижению их жизнеспособности.

За прототип принят способ индукции иммунологической толерантности у птиц путем подкожной имплантации долек (фрагментов) донорского тимуса между молодняком суточного возраста (Джером, Ф.Н. Методы искусственной толерантности в организме реципиента (домашней птицы) к тканям донора / Ф.Н.Джером, Л.И.Хейли, У.С.Лапп, Э.Г.Кендалл // Тр. XIII Всемирный конгресс по птицевод-ву. - Киев, 1966. - С.254). Этот способ достаточно технологичен, поскольку операция подкожной имплантации фрагментов донорского органа предельно проста и минимально травматична для реципиентов. К недостаткам способа относится то, что он недостаточно эффективен, поскольку реципиентам имплантируют лишь по 1-2 дольки тимуса. Объясняется это, прежде всего, тем, что операция прижизненного изъятия долек указанного органа у молодняка птиц технически трудно выполнима и высокотравматична для доноров суточного возраста. Кроме того, этот способ недостаточно экономичен, поскольку каждая прооперированная особь может послужить донором лишь для 1-2 реципиентов. Объясняется это тем, что общее количество долек тимуса у птиц невелико (не более 12-14 шт.) и изъятие существенной их части может нанести непоправимый вред здоровью донора.

Задача предлагаемого изобретения состоит в дальнейшей разработке биотехнических подходов к преодолению барьеров гистонесовместимости у птиц при их искусственной репродукции новыми методами.

Поставленная задача достигается способом индукции иммунологической толерантности у птиц, включающим проведение подкожной имплантации фрагментов донорского органа между молодняком суточного возраста, отличающимся тем, что в качестве имплантатов используют фрагменты печени, причем перед их изъятием доноров умерщвляют.

Технический результат заявленного способа заключается в том, что использование в качестве имплантатов фрагментов печени позволяет значительно (не менее чем в 4 раза) сократить потребность в донорах при индукции иммунологической толерантности у птиц, а умерщвление доноров позволяет повысить долю иммунотолерантных особей среди реципиентов.

Пример конкретного выполнения

Исследование было проведено в лаборатории биологических проблем птицеводства Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ВНИТИП). Экспериментальным материалом послужил суточный молодняк кур двух родительских линий яичного кросса «Радонеж», причем донорами имплантируемых органов явились цыплята линии ВР-1, а реципиентами - цыплята линии ВР-2. Подопытное поголовье птиц содержали в виварии института, а условия его содержания и кормления соответствовали нормам, рекомендованным ВНИТИП для молодняка кур яичного направления продуктивности.

Операции подкожной имплантации фрагментов донорского органа у цыплят-реципиентов проводили с соблюдением правил асептики и антисептики. Местом операции являлся неопушенный участок грудной клетки в области подкожной вены слева. Выше этой вены делали небольшой разрез кожи и через него скарифицировали подкожную клетчатку ниже указанной вены, а затем вносили и размещали на подготовленном месте фрагменты тимуса или печени. По завершении операции края кожного разреза сближали без наложения швов.

Схема эксперимента представлена в таблице 1.

Таблица 1 Схема эксперимента N группы Способ индукции иммунотолерантности Имплантируемый орган Количество долек (фрагментов) органа одной массы, шт. 1 (контр.) Известный Тимус 2 2 (опыт.) Новый Печень 2 3 (опыт.) Новый Печень 4 4 (опыт.) Новый Печень 6

При постановке эксперимента были сформированы 4 аналогичные группы цыплят-реципиентов по 24 головы в каждой.

Цыплятам-реципиентам 1 (контрольной) группы имплантировали по 2 дольки донорского тимуса, которые изымали прижизненно у цыплят-доноров, причем каждый из прооперированных цыплят послужил донором не более чем для 2 реципиентов. Цыплятам-реципиентам 2, 3 и 4 (опытных) групп имплантировали, соответственно, по 2, 4 и 6 фрагментов донорской печени, масса которых была аналогична массе долек тимуса и составляла около 0,015 г. При этом предназначенные для имплантации фрагменты печени изымали у цыплят-доноров, умерщвленных путем декапитации непосредственно перед проведением операции, а каждый из них послужил донором как минимум для 8 реципиентов.

По завершении операций подкожной имплантации долек (фрагментов) указанных органов цыплят-реципиентов выращивали до 15-недельного возраста, еженедельно отслеживая состояние имплантатов путем их осмотра и пальпации.

При проведении эксперимента учитывали относительное количество цыплят-реципиентов, сохранивших имплантаты донорского органа к концу каждой недели после имплантации, %.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически по методу Стьюдента.

Основные результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты эксперимента N группы Кол-во выживших реципиентов, гол. Относит. кол-во реципиентов, сохранивших имплантаты донорского органа к определенному сроку, % конец недели после имплантации 1 2 3 4 6 8 10 14-15 1 (к) 22 90,9 90,9 86,4 72,7 40,9 36,4 22,7 18,2 2 (о) 23 91,3 91,3 91,3 82,6 65,2 43,5 26,1 17,4 3 (о) 21 100,0 100,0 100,0 85,7 66,7 47,6 33,3 23,8 4 (о) 23 100,0 100,0 100,0 91,3 69,6 52,2 39,1 26,1* Значение достоверно: * при Р≤0,1

Как видно из таблицы 2, имплантация разного количества фрагментов донорских органов между цыплятами суточного возраста привела к различным результатам. Так, уже к концу 1-й недели после имплантации некоторая часть (около 9,0%) цыплят-реципиентов 1 (контрольной) и 2 (опытной) групп, которым имплантировали, соответственно, по 2 фрагмента донорского тимуса или печени, не имела ни одного прижившегося имплантата, тогда как среди цыплят-реципиентов 3 и 4 (опытных) групп, которым имплантировали, соответственно, по 4 и 6 фрагментов донорской печени, таких особей не оказалось. Начиная со 2-й недели после имплантации у большинства цыплят-реципиентов разных групп происходило постепенное отторжение (рассасывание) прижившихся имплантатов, но завершение этого процесса наблюдалось в разные сроки в период с 3 по 14-ю неделю после имплантации. Меньшая же часть цыплят-реципиентов всех групп сохраняла имплантаты донорского органа до конца указанного периода и не отторгала их в дальнейшем, что свидетельствовало о приобретении ими иммунологической толерантности. При этом доля таких иммунотолерантных особей среди реципиентов 1 (контрольной) и 2 (опытной) групп была сравнительно невысокой и составляла, соответственно, 18,2 и 17,4%, тогда как среди реципиентов 3 и 4 (опытных) групп она была существенно выше и достигала, соответственно, 23,8 и 26,1%, причем разность между указанными долями в последней группе была статистически достоверной.

Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что подкожная имплантация 2 фрагментов донорского органа между цыплятами суточного возраста не гарантирует приживления имплантатов у всех реципиентов и позволяет получить сравнительно небольшое количество иммунотолерантных особей, тогда как 2-3-кратное увеличение количества имплантируемых фрагментов донорского органа обеспечивает 100,0%-ное их приживление и приводит к существенному повышению доли иммунотолерантных особей среди реципиентов,

В таблице 3 представлены сведения о количестве цыплят-доноров, потребовавшихся при индукции иммунотолерантности у исходного количества реципиентов.

Как видно из таблицы 3, общее количество цыплят-доноров, потребовавшихся при индукции иммунотолерантности у исходного количества реципиентов известным способом, составляло 12 голов, тогда как при индукции иммунотолерантности у того же количества реципиентов новым способом потребность в донорах не превышала 2-3 головы. Объясняется это тем, что масса печени многократно (почти в 10 раз) превышает массу всех долей тимуса и поэтому каждая убитая особь может послужить донором фрагментов этого органа для большего количества реципиентов.

Таблица 3 Сведения о количестве цыплят-доноров N группы Исходное кол-во реципиентов, гол. Имплантируемый орган Кол-во долек (фрагментов) органа одной массы, шт. Кол-во потребовавшихся доноров, гол. 1 (к) 24 Тимус 2 12 2 (о) 24 Печень 2 2 3 (о) 24 Печень 4 2 4 (о) 24 Печень 6 3

Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что использование в качестве имплантатов донорского органа фрагментов печени позволяет как минимум в 4 раза сократить потребность в донорах при индукции иммунологической толерантности у птиц.

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый способ индукции иммунологической толерантности у птиц путем подкожной имплантации фрагментов донорской печени между молодняком суточного возраста значительного более эффективен и экономичен, чем известный способ.

Предлагаемый способ может быть использован для преодоления барьеров гистонесовместимости при искусственной репродукции птиц новыми методами.

Изобретение относится к области птицеводства. Способ включает проведение подкожной имплантации фрагментов донорского органа у молодняка суточного возраста. При этом в качестве имплантатов донорского органа используют фрагменты печени. Способ позволяет сократить потребность в донорах при индукции иммунологической толерантности у птиц. 3 табл.

Способ индукции иммунологической толерантности у птиц, включающий проведение подкожной имплантации фрагментов донорского органа у молодняка суточного возраста, отличающийся тем, что в качестве имплантатов донорского органа используют фрагменты печени.