ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER ВКПМ F - 790 - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОНОВОЙ И ЛИМОННОЙ КИСЛОТ Российский патент 2002 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Описание патента на изобретение RU2183218C2

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба Aspergillus niger ВКПМ F- 790, продуцирующего в зависимости от созданных условий лимонную кислоту (ее соли) или глюконовую кислоту (ее соли или глюконолактоны).

Известны штаммы гриба Aspergillus niger ВКПМ F-501 и Aspergillus niger ВКПМ F-171. Оба штамма предназначены исключительно для биосинтеза лимонной кислоты в промышленных условиях на сахаросодержащих средах различного состава [1, 2].

В процессе биосинтеза лимонной кислоты указанными штаммами образуется около 10% глюконовой кислоты к сумме всех кислот биосинтеза, что составляет от 7 до 8% относительно введенного сахара. Для целевого производства глюконовой кислоты или ее производных такие показатели биосинтеза интереса не представляют.

При обеспечении особых, благоприятных для образования глюконовой кислоты или ее производных условий [3], выход этих продуктов возрастает до 75-85% к введенному сахару. В качестве побочных продуктов образуются лимонная и щавелевая кислоты, затрудняющие выделение целевого продукта и теряющиеся безвозвратно.

Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма гриба Aspergillus niger, обладающего высокими показателями активности и продуктивности как при биосинтезе лимонной кислоты (ее солей), так и в процессе получения глюконовой кислоты (ее солей или глюконолактонов) в промышленных условиях.

Новый штамм получен селекцией из штамма мутанта Aspergillus niger ВКПМ F-171 (далее именуемого штамм Л-4) [2].

В течение пяти лет в условиях промышленного производства лимонной кислоты осуществляли отбор, рассев и изоляцию образцов культуры Л-4, подвергающихся в естественных условиях производства мутациям, которые сопровождались усилением кислотообразования, повышением устойчивости к бактериальному и дрожжевому инфицированию.

Особое внимание привлекают образцы культуры, обеспечивающие наряду с высокими технико-экономическими показателями в биосинтезе лимонной кислоты их существенное возрастание по сравнению с исходным штаммом Л-4 при получении глюконовой кислоты и ее производных.

О значении целевых продуктов биосинтеза, производство которых возможно на основе применения нового штамма, позволяет судить информация, представленная в работе [4].

Полученный в результате селекции штамм гриба Aspergillus niger имеет коллекционный номер ВКПМ F-790.

Культурально-морфологические признаки изучают у пятисуточных культур, выращенных на синтетической среде Чапека или сусло-агаровой питательной среде.

Культуральные признаки на среде Чапека.

Колония имеет диаметр 78±2 мм, окраска бежевая, в центре желтоватого цвета, приподнята над субстратом. Конидиальные головки в центре колонии крупные, расположены плотно, образуют возвышение, к краю их размер уменьшается. Размер аспорогенной зоны около 6 мм. Обратная сторона колонии складчатая, белая.

В таблице обобщены показатели вновь полученного штамма ВКПМ F-790 в сравнении с известным штаммом Л-4.

Как видно из таблицы, на среде Чапека штамм ВКПМ F-790 имеет иную окраску и внешний вид обратной стороны колонии.

Культуральные признаки на сусло-агаровой питательной среде.

Колония имеет в диаметре 95±1 мм. Окраска бежевая. Воздушный мицелий сильно развит. В центре конидиальные головки более крупные, расположены плотно, к краю мельчают. Размер аспорогенной зоны 14,5±1,5 мм. Обратная сторона колонии складчатая, белая.

В отличие от известного штамма (см. таблицу) штамм ВКПМ F-790 характеризует больший размер колоний, увеличение аспорогенной зоны и складчатость обратной стороны колонии.

Морфологические признаки идентифицируют у пятисуточных культур, выращенных на среде Чапека.

Конидиальные головки круглой формы, их диаметр 110±61 мкм, вздутие конидиеносца шаровидной формы диаметром 31±4 мкм. Стеригмы двухслойные: стеригмы первого порядка длиной 15±5 мкм, стеригмы второго порядка длиной 7,5±2,5 мкм, их поверхность покрыта выростами. Конидии соединены в цепочки сплюснутыми сторонами, лишенными выростов. Средний размер конидий 3,3±0,3 мкм. Конидиеносцы прямые, бесцветные, длина конидиеносцев 867±561 мкм, диаметр 10,5±3,5 мкм.

Сравнение с известным штаммом Л-4 показывает, что штамм ВКПМ F-790 имеет большие размеры конидиальных головок, меньше размер вздутия конидиеносцев, длину стеригм первого порядка, размер конидий и диаметр конидиеносца (см. таблицу).

Среди биохимических свойств штамма ВКПМ F-790 заслуживает упоминания его способность к росту и биосинтезу в более кислых средах, чем исходного штамма. При глубинном культивировании вновь полученный штамм ВКПМ F-790 имеет оптимум рН при биосинтезе глюконовой кислоты от 3,5 до 6,0 в отличие от известного штамма Л-4 (оптимум рН при аналогичном применении 5,5-6,0). Вероятно, именно этот признак штамма ВКПМ F-790 обеспечивает ему большую устойчивость по сравнению с Л-4 к бактериальному и дрожжевому инфицированию.

Новый штамм ВКПМ F-790 так же, как и известный Л-4, - аэроб, прототроф. Способен обеспечивать ферментацию от 20 ч до 12 суток. Хорошо хранится и воспроизводит свои свойства в виде сухих конидий (остаточная влажность 5-10 отн.%).

Активность и продуктивность нового штамма ВКПМ F-790 оценивают в промышленных (биосинтез лимонной кислоты и глюконата кальция) и лабораторных (биосинтез солей лимонной кислоты и глюконолактонов) условиях.

Под активностью понимают выход целевого продукта, полученный по отношению к введенному сахару за определенное время ферментации. О продуктивности процесса судят по объему продукта биосинтеза с единицы объема реактора в сутки.

Как видно из таблицы, при близких значениях активности и продуктивности нового и известного штаммов в биосинтезе лимонной кислоты штамм ВКПМ F-790 на 17-22% активнее и на 25-30 кг/м3 • сутки продуктивнее Л-4 при производстве глюконовой кислоты или ее производных. Эти показатели сопровождают меньшие концентрации побочных продуктов биосинтеза (см. таблицу).

Отношение к источникам азота.

Усваивает азот из минеральных солей и органических соединений: белков, пептидов, аминокислот.

Отношение к источникам углерода.

Усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, сорбозу, мальтозу; плохо утилизирует декстрин, крахмал, лактозу, галактозу.

Сущность изобретения поясняют некоторые конкретные примеры использования штамма ВКПМ F-790.

Пример 1.

Получение лимонной кислоты.

1.1. Получение посевного материала в виде конидий.

Конидии выращивают в камерах-термостатах с регулируемой температурой и влажностью на кюветах, заполненных слоем 1,5 см питательной средой состава, г/дм3:
Пивное сусло - 20
Мочевина - 1
Хлорид натрия - 20
Агар - 20
Артезианская вода - Остальное
рН перед стерилизацией 5,8.

Среду засевают культурой штамма F-790 и инкубируют в течение 7 суток в условиях принудительной аэрации стерильным воздухом, поддерживая следующий режим выращивания:
1-4 сутки: влажность - снижение от 80 до 60 отн.%;
5-7 сутки: влажность - снижение от 60 до 40 отн.%.

На 8 сутки температуру воздуха снижают до 18oС и собирают конидии вакуумным устройством. Сушат конидии при 32oС до остаточного содержания влаги 7 отн.%.

1.2. 3амачивание конидий.

4 г конидий замачивают в 1 дм3 стерильного водно-мелассного раствора, содержащего 50 г мелассы.

Выдерживают суспензию конидий на качалке с числом качаний 160 в мин в течение 7 ч при 34oС.

1.3. Выращивание посевного материала - инокулюма.

В промышленном посевном ферментаторе - инокуляторе объемом 10 м3 готовят питательную среду следующего состава, г/дм3:
Меласса - 50
Ферроцианид калия - 0,25
Оксалат аммония - 2
Сульфат цинка - 0,005
Сульфат магния - 0,25
Фосфат калия однозамещенный - 0,16
Артезианская вода - Остальное
Засевают на подготовленную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее посевной материал, инокулюм, выращивают, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 12 ч: температура 38oC, расход воздуха 200 м3/ч;
время до 24 ч: температура 37oC, расход воздуха 300 м3/ч.

1.4. Основная ферментация.

В промышленном ферментаторе объемом 100 м3 готовят 60 м3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Меласса - 60
Ферроцианид калия - 0,25
Оксалат аммония - 2
Сульфат цинка - 0,005
Сульфат магния - 0,25
Фосфат калия однозамещенный - 0,16
Артезианская вода - Остальное
рН 5,5.

Переводят инокулюм в ферментатор и ведут биосинтез в течение 5 суток, поддерживая следующий воздушно-температурный режим:
сутки 1: расход воздуха 1200 м3/ч, температура 37oC;
сутки 2: расход воздуха 1500 м3/ч, температура 36oC;
сутки 3: расход воздуха 1800 м3/ч, температура 36oC;
сутки 4: расход воздуха 2000 м3/ч, температура 34oC;
сутки 5: расход воздуха 2200 м3/ч, температура 34oC.

Начиная с 3 суток, производят доливы по 0,25 м3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Меласса - 500
Ферроцианид калия - 0,5
Оксалат аммония - 3
Артезианская вода - Остальное
После отделения биомассы получают 68 м3 раствора с суммарной кислотностью 10 мас.% и концентрацией лимонной кислоты 9 мас.% (6120 кг). Выход к затраченному сахару (8100 кг) 75,6%.

Пример 2.

Получение цитрата натрия.

2.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

2.2. Замачивание конидий.

0,1 г конидий замачивают в 700 см3 водно-мелассной среды, содержащей 40 г мелассы.

Выдерживают суспензию на качалке с числом качаний 160 в мин в течение 7 ч при 34oС.

2.3. Основная ферментация.

В лабораторном ферментаторе объемом 10 дм3 готовят 7 дм3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Сахароза - 150
Сульфат цинка - 0,005
Сульфат магния - 0,25
Диаммонийфосфат - 0,4
Фосфат калия однозамещенный - 0,16
Мочевина - 2
Артезианская вода - Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
сутки 1: температура 38oC, расход воздуха 100 дм3/ч,
сутки 2: температура 36oC, расход воздуха 150 дм3/ч,
сутки 3-5: температура 34oC, расход воздуха 220 дм3/ч.

Раствором 10 мас.% гидроксида натрия, начиная с 3 суток, поддерживают рН около 3,5.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, рН раствора доводят до 6,5. Получают 810 г цитрата натрия. Выход по отношению к использованному сахару (1070 г) 75,7%.

Пример 3.

Получение глюконата кальция.

3.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

3.2. Выращивание посевного материала - инокулюма.

В промышленном посевном ферментаторе - инокуляторе объемом 1 м3 готовят 600 дм3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Глюкоза - 25
Сульфат магния - 0,2
Сульфат марганца - 0,05
Диаммонийфосфат - 0,4
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2
Артезианская вода - Остальное
Засевают набухшую суспензию конидий на подготовленную стерильную питательную среду.

Далее инокулюм выращивают, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 12 ч: температура 38oC, расход воздуха 4 м3/ч,
время до 24 ч: температура 37oC, расход воздуха 5 м3/ч.

3.4. Основная ферментация.

В промышленном ферментаторе объемом 10 м3 готовят 7 м3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Глюкоза - 110
Сульфат магния - 0,2
Сульфат марганца - 0,05
Диаммонийфосфат - 0,2
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2
Артезианская вода - Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 6 ч: температура 37oC, расход воздуха 30 м3/ч,
время до 12 ч: температура 36oC, расход воздуха 40 м3/ч,
время до 24 ч: температура 35oC, расход воздуха 50 м3/ч.

В процессе ферментации 10 мас.% суспензией гидроксида кальция поддерживают рН среды 3,5-4,5.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, доводят рН гидроксидом кальция до рН 6,5 и получают 820 кг глюконата кальция. Выход по отношению к затраченному сахару (785 кг) 104,4% (теоретический выход кальция глюконата моногидрата 113% по отношению к глюкозе моногидрату).

Пример 4.

Получение глюконо-δ-лактона.

4.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

4.2. Замачивание конидий, как в примере 2.

4.3. Основная ферментация.

В лабораторном ферментаторе объемом 10 дм3 готовят 7 дм3 питательной среды следующего состава, г/дм3:
Глюкоза - 110
Сульфат магния - 0,2
Сульфат марганца - 0,05
Диаммонийфосфат - 0,2
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2
Артезианская вода - Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 3 ч: температура 37oC, расход воздуха 10 дм3/ч,
время до 6 ч: температура 36oC, расход воздуха 20 дм3/ч,
время до 12 ч: температура 34oC, расход воздуха 25 дм3/ч,
время до 24 ч: температура 34oC, расход воздуха 40 дм3/ч.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, доводят рН до 3,5 суспензией гидроксида кальция, осадок отделяют.

Получают 770 г глюконовой кислоты с выходом к затраченному сахару (790 г) 97,5%.

Глюконовую кислоту выделяют в виде глюконо-5-лактона после упарки до 60 мас.% и кристаллизации при 40oС.

С учетом потерь при кристаллизации выход глюконо-δ-лактона по отношению к сахару составляет 65%.

Технико-экономическая эффективность штамма ВКПМ F-790.

Новый штамм ВКПМ F-790 расширяет номенклатуру биопродуктов, синтезируемых плесневыми грибами вида Aspergillus niger в промышленных условиях.

Подобно известному штамму Л-4 он обеспечивает высокие технико-экономические показатели в производстве лимонной кислоты (ее солей). Это ценное качество сочетается со способностью с более высоким выходом по сахару (на 17-22%) и продуктивностью (на 20-30 кг/м3•сутки) по сравнению с известным штаммом производить глюконовую кислоту и ее производные.

Биосинтез глюконовой кислоты новым штаммом ВКПМ F-790 - высокоэффективный процесс, носящий характер биотрансформации.

Практические потери глюкозы связаны с ее расходом на накопление биомассы и дыхание. Высокая специфичность реакции, инициируемой штаммом ВКПМ F-790, приводит к снижению примесей побочных продуктов по сравнению с Л-4 от примерно 15% до 1,5%, определенных в сумме продуктов реакции.

Отмеченная большая устойчивость штамма ВКПМ F-790 к кислым средам в сравнении с Л-4 позволяет упростить производство глюконовой кислоты или глюконолактонов.

Из-за необходимости ведения процесса биосинтеза производных глюконовой кислоты при рН от 5,5 до 7 с помощью других штаммов-продуцентов глюконатов не удается получать глюконовую кислоту или глюконолактоны непосредственно в ходе биосинтеза. Обычно [4] получают глюконат кальция, кислотным разложением которого получают глюконовую кислоту. Штамм ВКПМ F-790 позволяет проводить биосинтез при рН около 3,5 и получать глюконовую кислоту в процессе биосинтеза.

Таким образом, штамм ВКПМ F-790 позволяет перестроить производства, использующие для биосинтеза гриб Aspergillus niger, с ориентации на монопродукт в гибкие современные производства, свободно ориентирующиеся по запросам и конъюнктуре рынка.

Информационные материалы.

1. SU1811697 A3, C 12 N 1/14.

2. SU 975799 С, C 12 N 15/08 (прототип).

3. RU 2132878 C1, C 12 P 7/40.

4. Промышленная микробиология. / Под ред. Н.С. Егорова. - М.; с.495 и 496, 498 и 499, 513 и 514.

Похожие патенты RU2183218C2

название год авторы номер документа
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1993
  • Ермакова В.П.
  • Голубцова В.М.
  • Садиков А.К.
  • Веселова А.А.
  • Саксон Е.Е.
  • Аюков В.В.
RU2080372C1
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER-ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1995
  • Ермакова В.П.
  • Голубцова В.М.
  • Саксон Е.Е.
  • Аюков В.В.
  • Сергеева Л.А.
  • Веселова А.А.
RU2088665C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1994
  • Ермакова В.П.
  • Голубцова В.М.
  • Саксон Е.Е.
  • Веселова А.А.
  • Сергеева Л.А.
  • Аюков В.В.
  • Коржова Н.В.
RU2099423C1
ШТАММ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА ASPERGILLUS NIGER-ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1995
  • Ермакова В.П.
  • Голубцова В.М.
  • Саксон Е.Е.
  • Аюков В.В.
  • Гиль Г.С.
RU2088666C1
ШТАММ Aspergillus niger - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 2013
  • Выборнова Татьяна Владимировна
  • Шарова Наталья Юрьевна
RU2558228C2
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 2000
  • Красикова Н.В.
  • Никифорова Т.А.
  • Финько В.М.
RU2192460C2
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1995
  • Красикова Н.В.
  • Никифорова Т.А.
  • Галкин А.В.
  • Финько В.М.
RU2088658C1
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1993
  • Щербакова Е.Я.
  • Никифорова Т.А.
  • Галкин А.В.
  • Жданова В.Н.
  • Мушникова Л.Н.
RU2089615C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 2005
  • Львова Елена Борисовна
  • Выборнова Татьяна Владимировна
RU2302462C2
ДИПЛОИДНЫЙ ШТАММ ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 2001
  • Щербакова Е.Я.
  • Никифорова Т.А.
  • Львова Е.Б.
RU2203322C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 183 218 C2

Реферат патента 2002 года ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER ВКПМ F - 790 - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОНОВОЙ И ЛИМОННОЙ КИСЛОТ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба Aspergillus niger ВКПМ F-790. В зависимости от создания условий штамм продуцирует лимонную кислоту или ее соли и глюконовую кислоту (в виде ее солей или глюконолактонов). Штамм ВКПМ F-790 позволяет перестроить производства, использующие для биосинтеза гриб Aspergillus niger, с получения монопродукта на получение нескольких продуктов, что экономически более выгодно. Новый штамм более устойчив в кислых средах, что позволяет упростить производство глюконовой кислоты. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 183 218 C2

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F- 790 - продуцент глюконовой и лимонной кислот.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2183218C2

Штамм гриба aSpeRGILLUS NIGeR л-4 продуцент лимонной кислоты 1980
  • Ермакова Вера Петровна
  • Щербакова Екатерина Яковлевна
  • Василинец Иван Михайлович
  • Финько Вера Михайловна
  • Шушкевич Тамара Ивановна
SU975799A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 1998
  • Карпун Е.В.
  • Кутина Н.Н.
  • Кирсанов А.Т.
  • Горбач Л.А.
  • Чумаков С.И.
  • Ветерханов С.Р.
RU2132878C1
СМИРНОВ В.А
Пищевые кислоты
- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983, с.92-93.

RU 2 183 218 C2

Авторы

Карпун Е.В.

Морозова Е.В.

Козлов В.П.

Наумов Е.Г.

Раменский П.А.

Кирсанов А.Т.

Даты

2002-06-10Публикация

1999-12-27Подача