БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ РАСТВОРА Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/26 

Изобретение относится к области экологического биомониторинга и радиоэкологии и может быть использовано для определения радиотоксичности растворов.

Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, измерение максимума биолюминесценции, по величине которого определяют концентрацию ингибитора [А.с. №865904, МПК С12Q 1/26, опубл. 23.09.81 г., бюл. №35].

Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей альдегид и НАДН в насыщающих концентрациях, люциферазу, НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ФМН и определение концентрации по величине интенсивности свечения [А.с. №1204639, МПК С12Q 1/26, опуб. 15.01.86 г., бюл. №2, прототип].

Недостатками этих способов являются низкая чувствительность определения концентрации ингибиторов биологической активности (до 10^-11 моль/л) и отсутствие возможности проводить анализ растворов радионуклидов.

Техническим результатом изобретения является разработка высокочувствительного способа определения радиотоксичности в растворах, содержащих радиоактивные элементы.

Технический результат достигается тем, что в биолюминесцентном способе мониторинга радиотоксичности растворов, включающем приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб, обработку реакционным раствором и измерение интенсивности биолюминесценции, новым является то, что рабочую пробу обрабатывают солевым раствором, содержащим радионуклиды, а в контрольную пробу добавляют солевой раствор и для накопления радиоактивного эффекта инкубируют пробы в течение 2-15 суток в одинаковых условиях при температуре ниже 20°С.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что рабочую пробу обрабатывают раствором, содержащим радионуклиды и для накопления радиоактивного эффекта инкубируют (выдерживают) пробы в течение 2-15 суток в одинаковых условиях при температуре ниже 20°С. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».

Известны технические решения, где использовались биолюминесцентные способы определения радиотоксичности, вызываемой гамма-излучением, с использованием светящихся бактерий [J.Min, С.W.Lee and M.В.Gu. Gamma-radiation dose-rate effects on DNA damage and toxicity in bacterial cells, Radiat EnvironBiophys, 2003, 42, 189, 192]. Однако чувствительность предлагаемого способа недостаточна для измерения малых и сверхмалых радиоактивностей. Накопление дозы облучения в результате процедуры инкубирования дает возможность расширить диапазон анализа радиотоксичности в сторону низких активностей и количественно оценить радиотоксичность, а это не известно из уровня техники и позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

На фиг.1 приведены зависимости биолюминесцентного индекса (БИ) от времени выдерживания пробы на основе клеточной суспензии 16 часовой культуры P.Phosphoreum 1883 IBSO суспензий для 3-х концентраций раствора америция: 1 - 10^-15 M; 2 - 10^-16 M; 3 - 10^-17 M.

На фиг.2 показаны величины БИ_макс и БИ_мин для трех типов тестовых систем (1 - интактные бактерии; 2 - лиофильно высушенные бактерии; 3 - система сопряженных ферментативных реакций) для 3-х концентраций нитрата америция: 10^-15 М (черный цвет), 5·10^-16 М (серый цвет) и 10^-17 М (белый цвет), соответствующих удельным активностям растворов 6000 Бк/л, 3000 Бк/л и 60 Бк/л.

Заявляемый биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности растворов осуществляется следующим образом: вначале готовят рабочую и контрольную пробы. Для приготовления рабочей пробы к суспензии бактерий или ферментов добавляют раствор радионуклидов (например, америция, урана или других радиоактивных элементов в солевом растворе NaNO₃, NaCl или др.). Для приготовления контрольной пробы к суспензии бактерий или ферментов добавляют только солевой раствор NaNO₃, NaCl или другой этой же концентрации. Пробы выдерживают (инкубируют) в одинаковых условиях при постоянной температуре ниже +20°С. Затем через определенные промежутки времени, например 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 4; 6; 8; 16; 24; 24 и т.д. часов, отбирают 10-50 мкл рабочей и контрольной суспензий для приготовления рабочего и контрольного растворов соответственно (приготовление растворов дано в примерах). Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра при температуре 10-35°С. Приготовление растворов и измерение интенсивности биолюминесценции продолжают до падения интенсивности биолюминесценции контрольного раствора на 80%. Данное ингибирование достигается в течение 2-15 суток (примеры 1-3). Необходимое время инкубирования уменьшается в следующем ряду биолюминесцентных тестовых систем: 1 - интактные бактерии; 2 - лиофильно высушенные бактерии; 3 - система сопряженных ферментативных реакций. Время инкубирования зависит от температуры выдерживания пробы: чем выше температура, тем меньше время инкубирования. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминесцентный индекс (БИ):

где:

I_Р - интенсивность биолюминесценции в рабочем растворе;

I_К - интенсивность биолюминесценции в контрольном растворе.

Строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. На фиг.1 показаны величины БИ_макс и БИ_мин соответственно для 3-х концентраций радиоактивного раствора нитрата америция (III): 10^-15 М - кривая 1; 5·10^-16 М - кривая 2; 10^-17 М - кривая 3. Чем выше БИ_макс и ниже БИ_мин, тем выше радиотоксичность раствора. Таким образом, величины БИ_макс и БИ_мин характеризуют влияние радиации на разные биолюминесцентные тестовые системы. При переходе от бактерий (1 на фиг.2) к ферментативным системам (3 на фиг.2) понижается чувствительность, такая же зависимость наблюдается и при переходе от целых бактериальных клеток (1 на фиг.2) к поврежденным при лиофильной сушке в процессе приготовлении коммерческого препарата (2 на фиг.2).

При использовании в качестве радиоактивного раствора нитрата уранила UO₂(NO₃)₂ способ осуществляется при тех же концентрациях и температурах инкубирования, что и в случае нитрата америция ²⁴¹Am(NO₃)₃, с теми же биолюминесцентными тестовыми системами. Получены аналогичные зависимости БИ от времени инкубирования.

Пример 1. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют клеточную суспензию 16 часовой культуры Photobacterium Phosphoreum 1883 IBSO или Photobacterium leiognathi, добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)₃ в 1.1 М растворе NaNO₃. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к этой же культуре бактерий 1.1 М раствора NaNO₃. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 24 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 50 мкл рабочей или контрольной пробы, 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора в течение 15 суток при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается БИ, строится зависимость биолюминесцентного индекса от времени инкубирования проб (фиг.1). Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 2. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют препарат Микробиотест 677 F, изготовленный на основе лиофилизированных светящихся бактерий P.Phosphoreum 1883 IBSO, к которому добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)₃ в 1.1 М растворе NaCl. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к билюминесцентной тестовой системе 1.1 М раствора NaCl. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 16 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов готовят следующим образом: 50 мкл суспензии бактерий (с америцием или без него), 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают в течение 10 суток (до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора) при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминисцентный индекс и строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 3. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют комплект Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ). Он включает лиофилизированные препараты люциферазы (0.5 мг/мл) и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (0.15 ед. активности). Для приготовления рабочей пробы к КРАБу добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)_з в 1.1 М растворе NaNO₃. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к КРАБу 1.1 М раствора NaNO₃. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре -4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 6 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 10 мкл раствора рабочей и контрольной пробы, 50 мкл 0.0025% раствора тетрадеканаля, 200 мкл 0.05 М калий-фосфатного буфера, 50 мкл 5·10^-4 М раствора ФМН, 200 мкл 4·10^-4 М раствора НАДН. Общий объем смеси - 500 мкл. Реакцию запускают раствором НАДН. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до заметного ингибирования биолюминесценции рабочего раствора в течение 2 суток (до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора) при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминисцентный индекс и строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 4. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют клеточную суспензию 16 часовой культуры бактерий Photobacterium Phosphoreum 1883 IBSO или Photobacterium leiognathi, добавляют радиоактивный раствор UO₂(NO₃)₂ в 1.1 М растворе NaCl. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к этой же суспензии бактерий 1.1 М раствора NaCl. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 24 к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 50 мкл рабочей или контрольной пробы, 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора в течение 15 суток при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается БИ, строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Заявляемый биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности растворов является не дорогим, высокочувствительным (позволяет давать количественную оценку радиотоксичности до 60 Бк/л, что соответствует концентрации, например, америция 10^-17 моль/л), а также гуманным, т.к. не использует высшие организмы. Способ может использоваться для мониторинга радиотоксичности природных и искусственно полученных радионуклидов и для мониторинга процесса детоксикации растворов радиоактивных элементов.

Изобретение относится к области экологического биомониторинга и радиоэкологии и может быть использовано для определения радиотоксичности раствора. Способ включает приготовление контрольной пробы, при этом используют солевой раствор, приготовление рабочей пробы с использованием солевого раствора, содержащего радионуклиды. Пробы инкубируют до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольной пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряют на протяжении всего процесса инкубирования, по значениям которой определяют радиотоксичность раствора. Способ обладает высокой чувствительностью. 2 ил.

Биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности раствора, включающий приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб, измерение интенсивности биолюминесценции, отличающийся тем, что при приготовлении контрольной пробы используют солевой раствор, а при приготовлении рабочей пробы - солевой раствор, содержащий радионуклиды, пробы инкубируют до 80%-ного ингибирования биолюминесценции контрольной пробы, при этом интенсивность биолюминесценции измеряют на протяжении всего процесса инкубирования, по значениям которой определяют радиотоксичность раствора.