ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ НА ОСНОВЕ РАЗРЯЖЕННЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ Российский патент 2011 года по МПК A61B5/00 G01N33/52 

Изобретение относится к области биофизики и может быть использовано в биологических и медицинских исследованиях для количественного определения концентрации кальция в различных средах.

Известен способ определения концентрации кальция, основанный на том, что оксалаты (соли щавелевой кислоты H₂C₂O₄) и сама щавелевая кислота образуют с солями кальция белые нерастворимые осадки [А.П.Крешков, А.А.Ярославцев. Курс аналитической химии, количественный анализ. Изд.: Москва «Химия», 1982].

Известен биолюминесцентный способ определения концентрации кальция. В данном способе используются ферменты кишечнополостных - фотопротеины. Способ основан на том, что в присутствии ионов кальция запускается биолюминесцентная реакция, и интенсивность биолюминесценции зависит от концентрации кальция. [В.А.Illarionov, L.A.Frank, V.A.Illarionova, V.S.Bondar, E.S.Vysotski, J.R.Blinks Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / J. Methods in enzymology. - 2000. - №. 277. - P.223-249]. В этом способе к 1 мл раствора, содержащего неизвестную концентрацию кальция, добавляют 10 мкл раствора 5·10^-6 М обелина в 20 мМ TrisHCl буфере, рН 7. Далее регистрируют интенсивность биолюминесценции с помощью биохемилюминометра. По калибровочной зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации кальция определяют концентрацию кальция в тестируемом растворе.

Недостатками этого способа являются невозможность количественного определения кальция в системах in vivo и необходимость проведения химической реакции для каждого измерения.

Техническим результатом изобретения является разработка способа определения концентрации кальция в различных средах по интенсивности флуоресценции разряженного фотопротеина.

Указанный технический результат достигается тем, что при флуоресцентном способе определения концентрации кальция на основе разряженных фотопротеинов, включающем проведение биолюминесцентной реакции фотопротеинов и ионов кальция, измерение интенсивности флуоресценции раствора, построение калибровочной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах и определение значения логарифма концентрации кальция по логарифму интенсивности свечения, новым является то, что флуоресценцию инициируют источником света после завершения биолюминесцентной реакции, измеряют интенсивность флуоресценции при заданной длине волны возбуждения и регистрации.

Заявляемый способ использует флуоресценцию разряженного фотопротеина, что позволяет проводить непрерывные измерения концентрации кальция в системах in vivo. Это отличие позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется чертежами:

На фиг.1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции в спектрах испускания разряженного фотопротеина обелина от концентрации кальция. Длина волны возбуждения 310 нм, длина волны регистрации 510 нм.

На фиг.2 представлена зависимость интенсивности флуоресценции в спектрах возбуждения разряженного фотопротеина обелина от концентрации кальция. Длина волны регистрации 470 нм, длина волны возбуждения 350 нм.

Аналогичные зависимости получены и при варьировании вязкости среды при добавлении в исследуемый раствор глицерина с образованием 1, 3, 5, 10 процентных растворов глицерина в водной среде.

Заявляемый способ определения концентрации кальция по интенсивности флуоресценции в спектре испускания осуществляется следующим образом.

Пример 1. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина обелина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин обелин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 460-540 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 335-365 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах (фиг.1).

Пример 1.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.

Пример 1.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апообелином с образованием фотопротеина обелина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.

Пример 2. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина акворина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин акворин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 440-530 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 320-350 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.

Пример 2.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.

Пример 2.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апоакворином с образованием фотопротеина акворина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.

Пример 3. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина клитина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин клитин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 400-500 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 320-350 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.

Пример 3.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного фотопротеина клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.

Пример 3.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апоклитином с образованием фотопротеина клитина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.

Заявляемый способ определения концентрации кальция по интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения осуществляется следующим образом.

Пример 4. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина обелина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин обелин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» обелина измеряют при длине волны возбуждения в диапазоне 335-365 нм и регистрации на длине волны в диапазоне 460-540 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах (фиг.2).

Пример 4.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.

Пример 4.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.

Пример 5. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина акворина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин акворин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина измеряют при длине волны возбуждения в диапазоне 320-350 нм и регистрации на длине волны в диапазоне 440-530 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.

Пример 5.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.

Пример 5.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.

Пример 6. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина клитина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10^-9 М, 10^-8 М, 5·10^-8 М, 10^-7 М, 5·10^-7 М, 10^-6 М, 5·10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин клитин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина измеряют при длине волны возбуждения, входящей в диапазон 320-350 нм и регистрации на длине волны, входящей в диапазон 400-500 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.

Пример 6.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10^-5 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.

Пример 6.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.

Преимущества заявляемого способа заключаются:

- в возможности непрерывного использования первоначально введенного индикатора в течение биохимического процесса любой длительности в живых клетках;

- в бóльшей интенсивности сигнала;

- фотолюминесценция удобнее в регистрации, поскольку измерения не связаны с проведением дополнительных биохимических процессов;

- и существует возможность использовать флуоресцентный репортер кальция в сочетании с биолюминесцентным анализом.

Изобретение относится к области биофизики. Для определения концентрации кальция на основе разряженных фотопротеинов проводят биолюминесцентную реакцию фотопротеинов и ионов кальция, измерение интенсивности флуоресценции раствора, построение калибровочной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах и определение значения логарифма концентрации кальция по логарифму измеренной интенсивности свечения. Флуоресценцию инициируют источником света, после завершения биолюминесцентной реакции. Измеряют интенсивность флуоресценции при заданной длине волны возбуждения и регистрации. Способ позволяет определить концентрацию кальция в различных средах по интенсивности флуоресценции разряженных фотопротеинов, что позволяет проводить непрерывные измерения концентрации кальция в системе in vivo. 2 ил.

Флуоресцентный способ определения концентрации кальция на основе разряженных фотопротеинов, включающий проведение биолюминесцентной реакции фотопротеинов и ионов кальция, измерение интенсивности флуоресценции раствора, построение калибровочной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах и определение значения логарифма концентрации кальция по логарифму измеренной интенсивности свечения, отличающийся тем, что флуоресценцию инициируют источником света после завершения биолюминесцентной реакции и измеряют интенсивность флуоресценции при заданной длине волны возбуждения и регистрации.