Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности Советский патент 1981 года по МПК C12Q1/26 C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения кошдентрации ингибиторов биологической активности (ароматических веществ) - пестицидов, фунгицидов, канцерогенов, веществ, являющихся компонентами сточных вод промьшшен ных предприятий. Известен способ количественного определения ингибиторов биологической активности путем измерения максимальной интенсивности свечения при обработке анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей лкщифёразу и ее субстраты l и t2 Однако чувствительность этого мето да недостаточна, так как максимальная интенсивность свечения имеет низкую чувствительность к малым концентрация ингибиторов, а величина зтого параметра варьирует при незначительных колебаниях концентраций компонентов реакций. Цель изобретения - увеличение чувствительности способа.; Поставленная цель достигается тем, что анализируемую пробу обрабаттявают реакционной смесью, содержащей дополнительно к люциферазе и ее субстратам НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насьщающих концентрациях, а количество ингибитора определяют по времени достижения максимума биолюми«есценции. Пример. Для определения концентрации 2,4-динитрофторбензола в растворе строят калибровочную кривую. Для этого используют препараты лю- циферазы, содержащий активность НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, полученный из бактерий рода Photo bacterium согласно методике, ограничиваясь стадией высаливания сульфатом аммония. Приготавливают раствор, содержащий 0,01 мл препарата люциферазы и НАДН- 1МН-оксидоредуктазы (1,28 мг белка в 1 мл препарата, 0,086 мл 510 раствора

ФМН, 0,08 мл 6,4

суспензии н-дб канапя, полученной озвучиванием при 800 кГц в течение 30 с 0,16 мл 1( фосфатного буфера рН 6,8 в общем объеме 1,2 мл. Свечение начинается при добавлении к этому раствору 0,4 МП 4-ld M раствора НАДН. Реакционная смесь барботируется воздухом. Реакцию проводят в термостати- руемой кювете при 20 С, измеряют время достижения максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси без вещества - 80 с. Ошибка при измерении tf al . При внесении

-10

i-10-n

МО

в реакционную смесь

л- 5- 1010 М 2,4-динитрофторбензола t 97,118,204,240 с соответстniQ

венно. По этим данным строят калибровочную кривую. При добавлении в реакцион ую смесь неизвестного количества 2,4-динитрофторбензола измеряют t. „ и сравнивают измеренную

dX„ „

величину с калибровочной кривой.

Так, если t IfeT с, концентрация 2,4-динитрофторбензола в растворе равна 2,4- 1(.

Аналогичным образом проводят построение калибровочных кривых для определения п бензохинона и толухинона..

На фиг. изображена динамик интенсивности биолюминесценции в реакционной смеси, содержащей люциферазу и ее субстраты (Б), и в. реакционной смеси, содержащей дополнительно НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты (А)5 на фиг.2 - изменение динамики интенсивности свечения при . действии разных ингибиторов биологической активности,

А. 2,4-Динитрофторбензола в концентрациях 0, 5 10 М, 1, 2 5 - Ш М, у 5-10, 1,25-10 1, 2,510, 4- 10 М (кривые 1-7 соответственно).

Б. П-Бензохинона в концентрациях О, ,., -1,25-10 М, З-Ю, 6,2510 М (кривые 1-5 соответственно) .

В, Толухинона. в концентрациях О, 1,25-10 М. 1,, 1,2510 М (кривые 1-4 cooTBeiCTBeHHo).

Предложенный способ позволяет увеличить чувствительность измерений

концентраций веществ по сравнению с известными способами. Предложенный способ является экспресс-методом анализа, прост. Не требует сложного оборудования и дорогостоящих материалов

5 и реактивов, доступен для заводских лабораторий. Способ может быть использован для определения степени загрязнения водоемов и сточных вод сулофатцеллюлогных и других предприятий.Формула изобретения

Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, о т л и.чающийся тем, что, с цапью повышения чувствительности анализа, в реакционную смесь добавляют НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты

в насьщенных концентрациях, измеряют время достижения максимума биолюминесценции и по его величине определяют концентрацию ингибитора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Hastings 1. W. Biochemistry, 1975, 14, № 19, p.4310-4316 (прото0 тип.

2.Hastings 1 .W., Ri Пеу W.H., Massa I. j. Bid. Chem, 1965. 240, p.1473-1481.