ВАКЦИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КУР И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КУР Российский патент 1995 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/42 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, в частности к средствам специфической профилактики сальмонеллеза кур.

Сальмонеллез кур, вызываемый Salmonella enteritidis, регистрируют во многих странах мира и регионах СССР. В последнее десятилетие он перерос в серьезную экономическую и социальную проблему.

Sal. enteritidis, адаптировавшаяся к организму кур, вызывает значительный отход цыплят (до 10-12%) и сальмонеллоносительство у взрослых кур. Инфицированные сальмонеллами продукты убоя птицы являются одним из основных источников возбудителя сальмонеллезной токсикоинфекции у человека.

Широкая распространенность Sal.enteritidis среди кур, значительный материальный ущерб, причиняемый птицеводству, опасность для человека, отсутствие эффективных лечебных препаратов, делают необходимым изыскание средств специфической профилактики этого сальмонеллеза у кур.

Известна вакцина против пуллороза-тифа кур, содержащая суспензию клеток штамма Sal.gallinarum - pullorum N 9 и стабилизатор (Gordon et al., 1959). Вакцина применялась на ограниченном поголовье кур. Вакцину вводили подкожно взрослой птице с целью получения трансовариального иммунитета у цыплят. Штамм 9R не имеет генетических маркеров для дифференциации от эпизоотических штаммов и как любой штамм в R форме имеет неполноценную антигенную структуру за счет утраты боковых цепей в молекулах полисахарида клеточной стенки. Кроме того, вакцина из штамма 9R вызывает у вакцинированной птицы патологоморфологические изменения в яичниках, характерные для пуллороза, что сделало эту вакцину непригодной для практического широкого применения.

Целью изобретения является вакцина против сальмонеллеза кур, обладающая безвредностью, высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Поставленная цель достигается получением вакцины, содержащей суспензию клеток штамма Sal. enteritidis 204, сахарозу, желатин и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов мас./об.%:
Суспензия клеток
штамма Sal.enteritidis
204 с концентрацией
175-250 млрд.

микробных клеток в 1 см³ 42,0-55,0 Сахароза 5,0-7,5 Желатин 1,5-2,0
Вода дистиллированная Остальное
Способ профилактики сальмонеллеза кур предусматривает введение в организм цыплят 2-3-дневного возраста с водой вакцины, содержащей суспензию клеток штамма Sal.enteritidis 204 с концентрацией 175-250 млрд/см³ микробных клеток в количестве 42,0-55,0 см³ и сахарозо-желатиновый стабилизатор в количестве 45-48 см³ из расчета 0,5-1,0 млрд/см³ микробных клеток на одного цыпленка, двукратно с интервалом 2 дня после 1-24-часовой голодной выдержки.

Используемый для изготовления вакцины штамм Sal.enteritidis 204 получают путем целенаправленной селекции из эпизоотического штамма Sal.enteritidis 126. Штамм депонирован в коллекции бактериальных культур Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов за номером 204.

П р и м е р 1. Получают устойчивый к рифампицину мутант (Rif^r) вирулентного штамма Sal.enteritidis 126, высевая взвесь бактерий (1 млрд/см³) на МПА, содержащий 100 мкг/см³ рифампицина. Rif^r-мутант сохраняет исходную вирулентность для мышей (ЛД₅₀ = 36 микробных клеток).

С помощью коньюгации в Rif^r-мутант вводят плазмиду Р^VD₃::Tn7 не способную реплицироваться в клетках Sal.enteritidis при температуре 43^оС. Выращивают трансконьюганты Sal.enteritidis 126 Rif^r (P^VD₃::Tn7) на МПА со стрептомицином (20 мкг/см³) при температуре 43^оС, отбирают инсерционные мутанты Sal.enteritidis 126 Rif^r::Tn7.

В экспериментах на белых мышах выявляют клоны мутантов, при заражении которми (внутрибрюшинно, доза 5х10⁴ микробных клеток) выживало бы 100% животных.

Штамм Sal.enteritidis 204 выявлен при анализе 54 инсерционных мутантов.

Штамм Sal. enteritidis 204 характеризуется следующими свойствами и признаками.

Морфология - мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул, имеют активную подвижность, перетрих. Размер палочек 2-3 х 0,6-0,7 мк.

Культуральные свойства - на мясопептонном бульоне образует равномерное помутнение через 5-7 ч культивирования при температуре 37^оС; затем образуется нежная пленка и выпадает серо-белый легко разбивающийся осадок. На мясопептонном агаре образует через 18-20 ч роста при температуре 37^оС колонии диаметром 0,8-1,5 мм в S форме, серо-белые, прозрачные, круглые, гладкие, мелкозернистые, выпуклые. Через 2-3 сут размер колоний увеличивается до 2-3 мм. Факультативный аэроб.

Ферментативные свойства - сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, сорбит, ксилозу, левулезу, галактозу, маннозу, тригалозу, декстрин, глицирин, дульцит инозит, образует сероводород, не сбраживает сахарозу, лактозу, арабинозу, раффинозу, инулин, салицин, адонит, не свертывает молоко, не образует индол, нитриты редуцирует в нитраты.

Антигенная структура - агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными "0" сыворотками: 1, 9, 12 и "Н" сыворотками: g, 1, 7. Неспецифическая фаза "Н" антигена (1 и 7) выявляется не постоянно.

Генетические маркеры - штамм устойчив к стрептомицину (150 мкг/см³), рифампицину (200 мкг/см³), триметоприму (200 мкг/см³). Маркеры устойчивости стабильно сохраняются после 10-кратных пересевов на мясопептонном агаре, 5-кратного пассажа через белых мышей и 5-кратного пассажа через цыплят.

Вирулентность для белых мышей. Исходный штамм Sal.enteritidis 126 имеет ЛД₅₀ для мышей линии Balb/с-18, для беспородных белых мышей - 5 микробных клеток. ЛД₅₀ штамма Rif^r составляет соответственно 36 и 14 микробных клеток, а для аттенюированного штамма Sal.enteritidis 204 - 1,6х10⁶ и 5,6х10⁶ микробных клеток.

Иммуногенность - выживаемость белых мышей и цыплят, иммунизированных аттенуированным штаммом 204, составляет после заражения 5-7 ЛД₅₀ вирулентного исходного штамма Salmonella enteritidis 80-95% от числа зараженных при гибели 90-100% животных в контроле.

П р и м е р 2. Реактор емкостью 200-500 л заполняют на 1/3 бульоном Хоттингера и стерилизуют при температуре 120^оС в течении 1 ч. Матровую расплодку аттенуированного штамма Sal.eteritidis 204 вносят в реактор в количестве 4,5-5,5% от объема среды. Культивирование проводят в течение 10-12 ч при температуре 37 ± 1^оС и постоянно работающей мешалке со скоростью 120± 5 об/мин и подаче стерильного воздуха в количестве 2 ± 0,2 объема/мин. Накопление микробных клеток составляет 35-50 млрд/см³ среды.

Выращенную культуру осаждают на роторной центрифуге типа СГО-100 при 12-15 тыс. об/мин. Бактериальную массу снимают с ротора в ламинарном боксе и смешивают в соотношении 1:2 со стабилизатором, содержащим сахарозу, желатин и дистиллированную воду.

Вакцину расфасовывают во флаконы объемом 10 см³ и лиофильно высушивают.

Вакцина против сальмонеллеза кур серии 1 имеет следующий компонентный состав, мас. /об. % : Суспензия клеток штамма Sal.enteritidis 204 с концентрацией 175 млрд/см³ 55,0 Сахароза 5,0 Желатин 1,5 Вода дистиллированная Остальное
Вакцина против сальмонеллеза кур серии 2 имеет следующий компонентный состав, мас./об.%: Суспензия клеток штамма Sal.enteritidis 204 с концентрацией 212,5 млрд/см³ 48,5 Сахароза 6,25 Желатин 1,75 Вода дистиллированная Остальное
Вакцина против сальманоллеза кур серии 3 имеет следующий компонентный состав, мас./об.%: Суспензия клеток штамма Sal.enteritidis 204 с концентрацией 250 млрд/см³ 42,0 Сахароза 7,5 Желатин 2,0 Вода дистиллированная Остальное
П р и м е р 3. Определяют оптимальную иммунизирующую дозу предложенной вакцины серии 2 для 2-3-дневных цыплят. Цыплят выдерживают 18-24 ч без воды и корма, после чего иммунизируют путем выпаивания вакцины с водой двукратно с интервалом 2 дня в дозе 0,5 млрд. живых микробных клеток на цыпленка. Цыплят заражают через 10-12 дней после выпаивания второй дозы вакцины внутримышечно в дозе 10 ЛД₅₀ вирулентным штаммом Sal.enteritidis N 126.

Опыт выполняют в трех повторениях. В каждом опыте используют по 20 вакцинированных и 20 невакцинированных цыплят. Результаты приведены в таблице
Среди вакцинированных цыплят выживаемость составила по трем группам 90% при гибели 83,3% цыплят в контроле.

Использование предложенной вакцины в ветеринарной практике позволит повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий при сальмонеллезе кур.

Использование: ветеринарная биотехнология, средства специфической профилактики сальмонеллеза кур, вакцина против сальмонеллеза кур, способ профилактики сальмонеллеза кур. Сущность изобретения: вакцина против сальмонеллеза кур содержит суспензию штамма Sal. enteritidis ВГНКИ N204 и желатино-сахарозный стабилизатор в эффективном количестве. Аттенуированный штамм Sal. enteritidis ВГНКИ N204 получен путем введения в исходный рифампинустойчивый штамм Sal. enteritidis N204 плазмиды с последующим отбором инсерционных мутантов. Использование новой вакцины против сальмонеллеза кур, содержащей в основе культуру аттенуированного штамма Sal. enteridis ВГНКИ N204, в ветеринарной практике позволяет повысить сохранность птицепоголовья до 90%. 2 с.п.ф-лы, 1 табл.

ВАКЦИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КУР И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КУР.

Вакцина против сальмонеллеза кур, содержащая суспензию клеток вакцинного штамма и сахарозо-келатиновый стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вакцинного штамма она содержит штамм Salmonella enteritidis ВГНКИ 204 с концентрацией живых микробных клеток (175-250)·10⁹ клеток/см³ при следующем соотношении компонентов, об.%:
Суспензия клеток штамма Salmonella enteritidis ВГНКИ
N 204 с концентрацией (175-250)·10³ клеток/см*9
93 - 42,0 - 55,0
Сахароза - 5,0 - 7,5
Желатин - 1,5 - 2,0
Дистиллированная вода - Остальное
2. Способ профилактики сальмонеллеза кур, включающий введение в организм цыплят вакцинного препарата, отличающийся тем, что в качестве вакцинного препарата используют вакцину, содержащую следующие компоненты, об.%:
Суспензия клеток штамма Salmonella enteritidis ВГНКИ
N 204 с концентрацией (175-250)·10⁹ клеток/см³ - 42,0 - 55,0
Сахароза - 5,0 - 7,5
Желатин - 1,5 - 2,0
Дистиллированная вода - Остальное
которую вводят цыплятам 2-3-дневного возраста с водой путем выпаивания из расчета (0,5-1,0)·10⁹ микробных клеток на одного цыпленка, двукратно с интервалом 48 ч после 18-24-часовой голодной выдержки.