ШТАММ БАКТЕРИЙ Salmonella enteritidis № 22, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/42 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к получению штамма Salmonella enteritidis, пригодного для использования в вакцинах и диагностических препаратах против сальмонеллеза животных.

Сальмонеллез характеризуется при остром течении лихорадкой, диареей и дегенеративными процессами в тонком и толстом кишечнике, при хроническом - воспалением легких.

Возбудитель - Salmonella enteritidis.

Сальмонеллез, вызываемый в том числе Salmonella enteritidis, регистрируется во многих странах мира, регионах России и стран СНГ. В последнее десятилетие он перерос в серьезную экономическую и социальную проблему.

Известен штамм Salmonella enteritidis 204 ВГНКИ, который входит в состав "Вакцины против сальмонеллеза кур" с концентрацией живых микробных клеток 175-250•10⁹ клеток/см³.

Штамм Salmonella enteritidis 204 обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул, имеют активную подвижность, перетрих. Размер палочек 2-3х0,6-0,7 мк.

Культуральные свойства. На МПБ образует равномерное помутнение через 5-7 ч культивирования при температуре 37^oС, затем образуется нежная пленка и выпадает серо-белый легко разбивающийся осадок. На МПА образует через 18....20 ч роста при температуре 37^oС колонии диаметром 0,8-1,5 мм в S - форме, серо-белые, прозрачные, круглые, гладкие, мелкозернистые, выпуклые. Через 2-3 суток размер колоний увеличивается до 2-3 мм. Факультативный аэроб.

Ферментативные свойства. Сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, сорбит, ксилозу, левулеза, галактозу, маннозу, тригалозу, декстрин, глицерин, дульцит, инозит, образует сероводород, не образует сахарозу, лактозу, арабинозу, раффинозу, инулин, салицин, адонит, не свертывает молоко, не образует индол, нитриты редуцирует в нитраты.

Антигенная структура. Агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными "О" сыворотками: 1, 9, 12 и "Н" сыворотками: g, 1,7. Неспецифическая фаза "Н" антигена (1 и 7) выявляется непостоянно.

Генетические маркеры - штамм устойчив к стрептомицину (150 мкг/см³ ), рифампицину (200 мкг/см³), триметоприму (200 мкг/см³). Маркеры устойчивости стабильно сохраняются после 10-кратных пересевов на МПА, 5-кратного пассажа через белых мышей и 5-кратного пассажа через цыплят.

Вирулентность для белых мышей. Исходный штамм Salmonella enteritidis 126 имеет ЛД₅₀ для мышей линии Валб/с - 18, для беспородных белых мышей - 5 микробных клеток. ЛД₅₀ штамма Rif составляет соответственно 36 и 14 микробных клеток, а для аттенуированного штамма Salmonella enteritidis 204 - 1,6•10⁶ и 5,6•10⁶ микробных клеток.

Иммуногенность - выживаемость белых мышей и цыплят, иммунизированных аттенуированным штаммом 204, составляет, после заражения 5-7 ЛД5о вирулентного исходного штамма Salmonella enteritidis - 80-95% от числа зараженных при гибели 90-100% животных в контроле (1).

Известен также фагоустойчивый, аттенуированный штамм Salmonella enteritidis ВГНКИ 204-R, который входит в качестве компонента с концентрацией (150-250)•10⁹, кл/см³ в "Препарат против сальмонеллеза кур".

Штамм Salmonella enteritidis 204-R, обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Грамотрицательная палочка без спор и капсул, размером 2-3х0,6-0,7 мк, перетрих.

Ферментативные свойства. Сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, сорбит, левулезу, галактозу, декстрин, глицерин, инозит, образует сероводород, не образует индол, нитриты редуцирует в нитраты.

Антигенная структура. Агглютинируется монорецепторными сальмонеллезными "О" сыворотками: 1,9, 12 и "Н" сыворотками: g, 1,7.

Генетические маркеры. Устойчив к стрептомицину (150 мкг/см³), рифампицину (200 мкг/ см³ ), триметаприму (200 мкг/см³). Маркеры стабильно сохраняются после 10-кратных пересевов на МПА и при 5-кратных пассажах на белых мышах и цыплятах.

Устойчив к действию штамма бактериофага F-6.

Вирулентность. ЛД₅₀ для белых мышей линии Валб/с - 5,6•10⁶ микробных клеток.

Иммуногенность. Выживаемость белых мышей и цыплят, иммунизированных аттенуированным штаммом, после заражения 5-7 ЛД₅₀ вирулентного штамма составляет 80-95% от числа зараженных животных, при гибели в контроле - 90-100% (2).

В задачу наших исследований входило получить штамм Salmonella enteritidis, обладающий стабильно низкой остаточной вирулентностью, высокой иммуногенностью и пригодный для изготовления вакцин против сальмонеллеза, а также диагностических препаратов.

Предложенный штамм бактерий Salmonella enteritidis 22 - возбудитель сальмонеллеза отнесен к семейству Enterobacteriaceae роду Salmonella, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина из тонкого отдела кишечника поросенка в 1988 году, колхоз "Лабинский", Краснодарского края.

Предложенный производственный штамм Salmonella enteritidis 22 депонирован 27 апреля 2001 года, регистрационный номер "штамм Salmonella enteritidis 22 МГАВМиБ - ДЕП", во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Salmonella enteritidis 14 - возбудителя сальмонеллеза телят - определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МВАВМиБ им. К.И. Скрябина, 23), дублирующее хранение НИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский пр-т, 121, в/ч 23527).

Предложенный производственный штамм Salmonella enteritidis 22 обладает следующими свойствами.

Морфологические, культуральные и ферментативные свойства.

Грамотрицательные, подвижные, полиморфные палочки образуют полупрозрачные S - колонии через 18.....24 ч роста на плотной питательной среде при температуре 36.....38^oС.

Ферментатвная активность. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, рамнозу, сорбит, маннит, не ферментирует лактозу, сахарозу, мальтозу, инозит, не гидролизует мочевину, образует сероводород, не образует индол и ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Серологические свойства. Агглюинируется с сальмонеллезной монорецепторной сывороткой 09 (1 и 5 комплекс) H-g.

Токсигенность. Штамм является продуцентом эндотоксина и гемолизина.

Вирулентность. ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 2,4•10⁶ живых м.к.

Патогенен для новорожденных телят при пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.к., через 24 ч наблюдают диарею, на 2-3 сутки - гибель животных.

Белковая структура.

Нуклеотидный состав ДНК (%ГЦ) - 53,1.

Содержит плазмиды с м.в. 60 МД.

Фагоцитируемость. Лизируется с поливалентным бактериофагом.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных амплитудах при минус 18...20^oC после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах - 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения 10 лет.

Пример. Штамм Salmonella enteritidis 22 выращивают в реакторах в казеиновом бульоне. Плотность посева 150-250 млрд. м.к. на 1 см³ питательной среды.

Культивирование проводят при температуре 36-37^oC при интенсивном механическом перемешивании и аэрацией воздухом из расчета объем стерильного воздуха 1 л питательной среды в соотношении 1:3. Через 16....18 ч культивирования концентрация микробных клеток достигает 40-50 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасевича, что дало возможность применить штамм для изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и пушных зверей.

Вакцина, изготовленная с использованием предложенного штамма, обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами на 5-7 сутки.

Вакцина из производственного штамма Salmonella enteritidis 22 апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 гг. на территории России и стран СНГ: Беларусь, Кыргызстан, Узбекистан и др. на 11550 головах стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей.

Сохранность поголовья составляет 95-99%.

Предложенный штамм найдет применение для изготовления сальмонеллезных вакцин и диагностикумов, а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Источники информации
1. Патент РФ 2030916, кл. А 61 К 39/112, 1995г.

2. Патент РФ 2026082, кл. А 61 К 39/112, 1995г.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Штамм бактерий Salmonella enteritidis 22, обладает в отношении морфологических, культуральных и ферментативных свойств присущих роду сальмонелла. По серологическим свойствам предложенный штамм агглютинируется с сальмонеллезными монорецепторными сыворотками 09 (1 и 5 комплекс) Н-G. Штамм является продуцентом эндотоксина и гемолизина. Имеет белковую структуру. Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) - 53,1. Содержит плазмиды с м.в. 60 МД. Лизируется с поливалентным бактериофагом. Вирулентные свойства: ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 2,4•10⁶ живых микробных клеток. Патогенен для новорожденных телят, при пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.к., через 24 ч наблюдают диарею, а на 2-3 сутки - гибель животного. Концентрация микробных клеток при выращивании штамма составляет 40-50 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасевича, защитный эффект от заражения вирулентными штаммами наступает на 5-7 сутки. Штамм пригоден для изготовления вакцин против сальмонеллеза животных, а также для изготовления диагностических препаратов и для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Штамм бактерий Salmonella enteritidis ВГНКИ №22 МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов.