СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К ДЕЗИНФЕКТАНТАМ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 A61L2/16 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии.

Известен способ определения чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам [1]. Способ заключается в том, что взвесями бактерий с плотностью 2×10⁹ КОЕ/мл контаминируют штифты штампа-репликатора и высушивают в асептических условиях на воздухе при комнатной температуре. Затем осуществляют дезинфекцию штифтов в лунках штампа-репликатора, в которые внесен тестируемый раствор дезинфектанта. После 10-минутной экспозиции в дезинфектанте штифты переносят в лунки другого штампа-репликатора, заполненные нейтрализатором, соответствующим тестируемому дезинфектанту, и выдерживают в нем 10 мин. Контроль обеспечивается использованием дистиллированной воды вместо дезинфектанта. По истечении времени экспозиции опытные и контрольные репликаторы (штифты) извлекают из нейтрализатора и осуществляют посев-реплику на среду АГВ или другую питательную среду на чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют 48 ч при 37°С и учитывают наличие или отсутствие роста бактерий в зонах посевов-отпечатков, считая культуру устойчивой к тест-раствору дезинфектанта при наличии роста в зонах посева.

Недостатки известного способа.

1. Применение достаточно сложного оборудования - штампов-репликаторов, которых должно быть несколько: для микробных культур, для растворов дезинфектантов и для раствора нейтрализатора.

2. Выполнение способа в 2 этапа: в штампах-репликаторах и на питательной среде.

Недостаток известного способа заключается в длительности (2 этапа) и необходимости использования нестандартного оборудования, не производимого промышленностью.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является ускоренный и упрощенный способ определения антибактериальной активности дезинфекционных средств [2]. Способ основан на применении питательной среды с pH-индикатором, изменяющим цвет под влиянием жизнедеятельности (метаболизма) размножающихся бактерий. Эффективные концентрации дезинфектанта предотвращают размножение бактерий, что не приводит к изменению цвета среды.

В качестве pH-индикатора используют бромтимоловый синий.

Исследование проводят в стерильных 96-луночных пластмассовых планшетах разового использования с объемом лунок 200,0 мкл. Во все лунки вносят по 100,0 мкл питательной среды с pH-индикатором. В первые лунки каждого ряда вносят по 100,0 мкл начального разведения раствора дезинфекционного препарата, разведенного до нужной концентрации, равной удвоенной концентрации, рекомендованной для практики. Поэтому начальным разведением служит та концентрация, которая установлена для практического применения или более низкая, если дезинфектант в обычной концентрации неблагоприятно влияет на окраску питательной среды с pH-индикатором.

В лунки с разведениями дезинфицирующих средств и контролем (кроме контроля среды) вносят по 50,0 мкл взвеси испытуемых бактерий (5,0×10⁷ микробных клеток/мл). Планшеты покрывают крышками и помещают в термостат с температурой, оптимальной для данного вида бактерий.

Учет результатов проводят после термостатирования по изменению исходного цвета питательной среды и появлению мутности. По мере роста бактерий в питательной среде они снижают pH, что влечет за собой изменение цвета среды: эффективное дезинфицирующее средство должно предотвращать конверсию цвета, а неэффективное - наоборот, вызывать.

Сами авторы этого способа отмечают, что некоторые дезинфицирующие средства в рабочих концентрациях уже сами по себе могут искажать интенсивность цвета питательной среды, поэтому убедительными изменениями следует считать результаты, когда цвет питательной среды приобрел явно желтую окраску. Кроме того, не все виды бактерий изменяют цвет среды на желтый. Так, при внесении в питательную среду Pseudomonas уже через 3 часа цвет среды становится синим, что свидетельствует не о снижении, а о повышении pH.

Учитывая отмеченные выше недостатки, авторы этого способа предлагают все дезинфицирующие средства при оценке эффективности данным способом делить на 3 группы, руководствуясь значением pH: кислые, нейтральные и щелочные. Кислые препараты характеризуются тем, что сразу после добавления к питательной среде с pH-индикатором меняют ее цвет на желтый. Испытывать такие препараты можно, лишь начиная с тех концентраций, которые не искажают исходный цвет питательной среды. Аналогичным образом щелочные препараты затруднительно использовать из-за того, что после добавления они меняют цвет питательной среды с pH-индикатором на светло-синий.

Трудности возникают и с некоторыми дезинфицирующими средствами, которые сами по себе изменяют цвет питательной среды, например «Септабик», который применяют в концентрациях 0,2-2,0%, в концентрациях 1,0-2,0% он обесцвечивает питательную среду, а в концентрациях 0,5% искажает ее исходный цвет. Поэтому эффективность «Септабика» этим способом возможно оценить при его концентрациях ниже 0,5%.

Таким образом, недостатки известного способа заключаются в низкой эффективности и ограниченности его применения.

Задача заявляемого изобретения заключается в повышении эффективности способа и расширении функциональных возможностей.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения устойчивости бактерий к дезинфектантам, включающем приготовление раствора дезинфектанта, бактериальной культуры и питательной среды с индикатором цветности с последующим внесением бактериальной культуры в дезинфектант, находящийся в лунках планшеты, и термостатирование смеси с визуальным определением цвета питательной среды через 4-24 часа, в качестве индикатора цветности используют редокс-индикатор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, а после экспозиции в течение 15-30 мин бактериальной культуры в растворе дезинфектанта полученную смесь переносят в предварительно внесенный в лунки планшеты и высушенный в них нейтрализатор дезинфектантов, выдерживают ее в течение 30 минут и переносят в лунки, содержащие предварительно высушенную в них питательную среду с редокс-индикатором.

Сущность заявляемого способа состоит в применении в качестве индикатора, изменяющего цвет питательной среды под влиянием метаболизма размножающихся бактерий, не pH-, а редокс-индикатора 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида с концентрацией 0,02% и в применении высушенных и готовых к использованию ингредиентов: универсального нейтрализатора дезинфектантов и стандартной питательной среды (трипказо-соевый бульон) с редокс-индикатором, находящихся в лунках планшеты.

Редокс-индикатор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (эмпирическая формула C₁₉H₁₅N₄Cl) является окислителем, бесцветен, при присоединении электронов восстанавливается в стойкое вещество формазон красного цвета [3]. Он относится к тетразолиевым солям, которые применяются при калориметрических определениях, испытаниях в пищевой и фармацевтической промышленности, при детектировании изменений, происходящих в живых телах, при исследованиях обмена веществ и метаболизма.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где на фиг.1 представлена планшета (устройство для определения устойчивости бактерий к дезинфектантам) до проведения эксперимента со следующими условными обозначениями:

- пустые лунки для внесения дезинфектантов в различных концентрациях (последний ряд лунок используется для выполнения контролей и заполняется стерильной водопроводной водой, на которой разводятся дезинфектанты);

- лунки с сухим нейтрализатором дезинфектантов;

- лунки с сухой питательной средой и редокс-индикатором.

На фиг.2 представлена планшета с одним из вариантов разметки при исследовании двух культур бактерий и трех различных дезинфектантов со следующими условными обозначениями:

Секторы I-VI - опытные - ряды лунок 1-9, сектор К - контрольный - ряды лунок 10-12. Буквой Р обозначены лунки, куда вносятся в процессе исследований рабочие концентрации дезинфектантов, 1/2, 1/4 и 1/8 - разведения дезинфектантов от рабочей концентрации, буквами КС обозначен контроль среды, KK₁ - контроль первой культуры, КК₂ - контроль второй культуры, KH₁ и КН₂ - контроль первой и второй культуры, соответственно, после экспонирования в нейтрализаторе.

На фиг.3 - вариант заполнения протокола определения устойчивости бактерий к дезинфектантам (по приведенному ниже примеру).

Цифровые и буквенные обозначения на чертежах по боковому и верхнему краю планшеты даны как система координат, позволяющая применять секторный принцип проведения исследований и учета результатов.

Заявляемый способ реализуется с помощью планшеты, которая представляет собой стерильную пластмассовую 96-луночную (12 рядов по 8 лунок объемом 200,0 мкл) планшету разового пользования с крышкой (фиг.1). Четыре вертикальных ряда лунок (1-й, 4-й, 7-й, 10-й) не содержат ингредиентов; четыре расположенных рядом с ними ряда лунок (2-й, 5-й, 8-й, 11-й) содержат универсальный нейтрализатор дезинфектантов в высушенном состоянии; четыре ряда (3-й, 6-й, 9-й и 12-й) содержат предварительно высушенную непосредственно в лунках планшеты питательную среду с редокс-индикатором. Универсальный нейтрализатор и питательная среда с редокс-индикатором вносятся в лунки планшеты заранее, в асептических условиях, в объеме 100,0 мкл и подвергаются сушке. Планшеты хранятся в стерильной укладке в холодильнике до момента их использования.

В качестве нейтрализатора используют смесь следующего состава: твин 80 - 3,0 г, цистеин - 0,1 г, гистидин - 0,1 г, сапонин - 3,0 г, буфер М/15-10,0 мл; стерилизация - 121°С 15 мин. [4]. В качестве питательной среды - трипказо-соевый бульон производства bioMerieux с редокс-индикатором ТТХ [3].

Последовательность операций в способе

1. Приготовление бактериальной суспензии исследуемой культуры: 18-20-часовые агаровые культуры микроорганизмов смывают стерильным 0,85% раствором хлорида натрия с добавлением 20,0% лошадиной сыворотки или 0,1% альбумина. Полученную бактериальную суспензию тщательно перемешивают, при наличии хлопьев и неравномерной взвеси - с помощью шейкера, и стандартизируют тем же раствором до плотности 1 млрд/мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича или аналогичному стандарту Мс Farnland.

2. Приготовление растворов дезинфектантов: растворы дезинфектантов, начиная с рабочей концентраии, готовят в ряду пробирок с использованием стерильной водопроводной воды и в макрообъемах (50-100 мл), что снижает погрешность в концентрациях препарата.

3. Подготовка планшеты (устройства для определения устойчивости бактерий к дезинфектантам): планшету извлекают из упаковки и выполняют «разметку» на ее крышке с учетом выбранного варианта постановки опыта. Один из вариантов разметки представлен на фиг.2.

4. В ряды лунок с высушенным нейтрализатором (2-й, 5-й, 8-й и 11-й) и питательной средой с редокс-индикатором (3-й, 6-й, 9-й и 12-й) 8-канальной пипеткой вносят по 100,0 мкл стерильной дистиллированной воды и перемешивают содержимое лунок до полного растворения. Роль нейтрализатора - остановить действие дезинфектанта на бактериальную культуру.

5. В ряды пустых лунок (1-й, 4-й и 7-й ряды) вносят по 100,0 мкл дезинфектантов в рабочих концентрациях (наименьшая концентрация из рекомендованных инструкцией по применению препарата в качестве рабочей) и 1/2,1/4 и 1/8 от нее; например в лунки первого ряда А, В, С, D (сектор I) и Е, F, G, Н (сектор II) вносят славин, в лунки четвертого ряда А, В, С, D (сектор III) и Е, F, G, Н (сектор IV) - инкрасепт, в лунки седьмого ряда (сектор V, VI) - КДИ (комплексный дезинфектант инструментов).

6. В лунки с разведениями дезинфектантов (1-й, 4-й и 7-й ряды) и пустые лунки 10-го ряда со 100,0 мкл водопроводной воды (контроли) вносят по 20,0 мкл суспензии испытуемой бактериальной культуры, стандартизированной до 1 млрд взвеси.

7. После экспозиции бактериальной культуры в растворе дезинфектанта по 20,0 мкл из содержимого лунок 1-го, 4-го и 7-го рядов переносят 8-канальной пипеткой в раствор нейтрализатора (лунки рядов 2-го, 5-го и 8-го), а также из лунок контрольного сектора: из лунок 10-го ряда в 11-й ряд (контроль роста исследуемых культур) после экспонирования в нейтрализаторе (КН).

8. После 30-минутной экспозиции в нейтрализаторе по 20,0 мкл содержимого лунок рядов 2-го, 5-го, 8-го и контрольного 11-го переносят в лунки с питательной средой и тщательно перемешивают многоканальным перемешиванием.

9. Лунки 10-го, 11-го и 12-го рядов используют для выполнения контролей:

- контроля роста исследуемой бактериальной культуры (КК);

- контроля роста этой же культуры после экспонирования в нейтрализаторе (КН);

- контроля питательной среды с редокс-индикатором (КС).

10. Планшету помещают в термостат при 37°С на 18-24 часа, после чего производят оценку полученных результатов.

Наличие в питательной среде редокс-индикатора позволяет зарегистрировать изменение окислительно-восстановительного потенциала ввиду размножения бактерий по изменению цвета среды. Бактерицидное действие дезинфектанта вызывает гибель бактерий, в результате чего сохраняется исходный цвет среды.

Изменение цвета среды в лунках (3-го, 6-го, 9-го и 12-го ряда в контролях КК и КН) от исходного желтого до ярко-розового свидетельствует о размножении бактерий, дезинфектант оценивается как неэффективный, а испытуемая бактериальная культура - как устойчивая.

Сохранение исходного желтого цвета в контроле среды с индикатором (КС) и лунках после воздействия дезинфектанта в рабочей и в разведенных концентрациях свидетельствует о том, что роста бактерий нет, дезинфектант оценивается как эффективный, а испытуемая бактериальная культура - как чувствительная.

Осуществление заявляемого способа поясняется следующим примером.

ПРИМЕР

Изучена устойчивость 2 штаммов бактерий: Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa №231Г) и Echerichia coli (E.coli №375H) к 3 дезинфектантам (славину, инкрасепту и КДИ).

Последовательность операций в примере

1. Приготовление бактериальной суспензии исследуемых культур (Р. aeruginosa и Е.coli): для приготовления бактериальной суспензии 18-20-часовые агаровые культуры этих микроорганизмов смывают стерильным 0,85% раствором хлорида натрия в объеме 5,0 мл с добавлением 20,0% лошадиной сыворотки или 0,1% альбумина. Полученную бактериальную суспензию тщательно перемешивают; при наличии хлопьев, неравномерной взвеси - с помощью шейкера, и стандартизируют тем же раствором до плотности 1 млрд/1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича или аналогичному стандарту Мс Farnland.

2. Приготовление растворов дезинфектантов: растворы дезинфектантов, начиная с рабочей концентрации, готовят во флаконах с использованием стерильной водопроводной воды в макрообъемах (50 мл):

- для приготовления рабочей концентрации славина к 49,75 мл стерильной водопроводной воды добавляли 0,25 мл славина;

- для приготовления аналогичного раствора инкрасепта к 49,0 мл стерильной водопроводной воды добавляли 1,0 мл инкрасепта;

- для приготовления КДИ - к 49,5 мл стерильной водопроводной воды добавляли 0,5 мл коммерческого раствора КДИ.

3. Подготовка устройства для определения устойчивости бактерий (планшеты):

- планшету извлекали из упаковки и выполняли ее маркировку (разметку) на крышке с учетом выбранного варианта постановки опыта (фиг.2 и фиг.3) с одновременным заполнением протокола исследования (фиг.3). В секторах I, III и V исследовали культуру Ps. aeruginosa, а секторах II, IV и VI - культуру Е.coli по чувствительности-устойчивости к славину (сектор I и II), инкрасепту (сектор III и IV) и КДИ (сектор V и VI). В секторе К выполняли контроли опыта;

- в лунки планшеты с высушенными ингредиентами (нейтрализатором - ряды лунок 2, 5, 8, 11 и питательной средой с редокс-индикатором - ряды 3, 6, 9, 12) 8-канальной пипеткой вносили по 100,0 мкл стерильной дистиллированной воды и перемешивали содержимое лунок до полного растворения.

4. Проведение исследования:

- в ряды пустых лунок (1-й, 4-й, 7-й) внесли по 100,0 мкл дезинфицирующих веществ в рабочей концентрации (0,5% для славина, 2,0% для инкрасепта и 1,0% для КДИ) и 1/2, 1/4 и 1/8 от них, т.е. в лунки первого ряда А, В, С, D (сектор I) и Е, F, G, Н (сектор II) внесли славин, лунки 4-го А, В, С, D (сектор III) и Е, F, G, Н (сектор IV) - инкрасепт, лунки 7-го (сектор V, VI) - КДИ;

- в лунки с дезинфектантами (1-й, 4-й, 7-й ряды) и пустые лунки 10-го ряда (контроли), куда внесли предварительно по 100,0 мкл водопроводной воды, добавили по 20,0 мкл исследуемых бактериальных культур, стандартизированных до 1 млрд/мл: Ps. aeruginosa (сектора I, III, V и К) и Е.coli (сектора II, IV, VI и К).

- после экспозиции (30 минут для славина, 15 минут для инкрасепта и КДИ) бактериальной культуры в растворе препаратов по 20,0 мкл из содержимого лунок этих рядов (1-го, 4-го, 7-го), а также из лунок контрольного сектора (10 ряда) перенесли 8-канальной пипеткой в раствор нейтрализатора (ряды 2-й, 5-й, 8-й и 11-й). В 11-м ряду выполняли контроль роста исследуемых культур после экспонирования в нейтрализаторе (КН);

- после 30-минутной экспозиции в нейтрализаторе по 20,0 мкл содержимого лунок 2-го, 5-го, 8-го рядов и контрольного 11-го перенесли в лунки с питательной средой и тщательно перемешали;

- лунки 10-го, 11-го и 12-го рядов использовали для выполнения контролей:

- KK₁ - контроль роста Ps. aeruginosa (синегнойной палочки) и КК₂ - контроль роста Е.coli (кишечной палочки) после экспозиции в нейтрализаторе;

- KH₁ и КН₂ - контроль роста этих же культур после экспонирования в нейтрализаторе;

- КС - контроль питательной среды с редокс-индикатором.

5. Инкубирование планшеты: после выполнения вышеуказанных действий планшету закрывали крышкой и помещали в термостат при 37°С на 18-24 часа.

6. Учет результатов: наличие в питательной среде редокс-индикатора позволяет зарегистрировать изменение окислительно-восстановительного потенциала ввиду размножения бактерий по изменению цвета среды. Бактерицидное действие дезинфектанта вызывает гибель бактерий, в результате чего сохраняется исходный цвет среды. Учет результатов начинали с контролей:

- контроли роста бактериальных культур (КК₁ и КК₂; KH₁ и КН₂): цвет питательной среды изменился, стал розовым, что свидетельствует о жизнеспособности и активном метаболизме исследуемых культур;

- контроль питательной среды (КС): цвет питательной среды с индикатором не изменился (остался желтым), что говорит об отсутствии ее контаминации и/или спонтанной реакции индикатора.

Учет результатов опыта по примеру: изменение цвета питательной среды на розовый отмечено в протоколе знаком «+». При учете результатов опыта отмечено изменение цвета питательной среды во всех лунках (А, В, С, D) 3-го ряда I сектора и лунках С и D ряда 6-го, что свидетельствует об устойчивости синегнойной палочки к рабочей концентрации славина и 1/4 от рабочей концентрации инкрасепта. Изменение цвета питательной среды в лунках G и Н ряда 3-го и лунки Р рядов 6-го и 9-го свидетельствует об устойчивости кишечной палочки к 1/4 от рабочей концентрации славина и 1/8 - инкрасепта и КДИ.

Источники информации

1. Гудкова Е.И., Красильников А.П. «Методика определения и показатели чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам» / Клиническая лабораторная диагностика. - 1994, №6, с.48-50.

2. Леви М.И., Сучков Ю.Г. «Ускоренный и упрощенный способ определения антибактериальной активности дезинфекционных средств»/ Дезинфекционное дело. - 1999, №3. c.30-33.

3. Р.Досон и др. Справочник биохимика. - Москва: «Мир». 1991, с.302.

4. European Standart CEN/TC216/HWG, №46 Е.С. 7, Dec. 1992, Brussels.

Готовят раствор дезинфектанта, бактериальной культуры и питательной среды с индикатором цветности, в качестве которого используют редокс-индикатор - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид. В приготовленный раствор дезинфектанта вносят бактериальную культуру и после экспозиции в течение 15-30 мин полученную смесь переносят в лунки планшеты с питательной средой и предварительно внесенным и высушенным в ней нейтрализатором дезинфектантов. Выдерживают ее в течение 30 мин и переносят в лунки, содержащие предварительно высушенную в них питательную среду с редокс-индикатором цветности. Планшету помещают в термостат при температуре 37°С на 4-24 ч, после чего проводят оценку полученных результатов по изменению цвета среды. Изменение цвета среды в лунках от исходного желтого до ярко-розового свидетельствует о размножении бактерий, а дезинфектант оценивается как неэффективный. Изобретение обеспечивает повышение эффективности способа и расширение его функциональных возможностей. 3 ил.

Способ определения устойчивости бактерий к дезинфектантам, включающий приготовление раствора дезинфектанта, бактериальной культуры и питательной среды с индикатором цветности и последующее внесение бактериальной культуры в дезинфектант, находящийся в лунках планшеты, и термостатирование смеси с визуальным определением цвета питательной среды через 4-24 ч, отличающийся тем, что в качестве индикатора цветности используют редокс-индикатор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, а после экспозиции в течение 15-30 мин бактериальной культуры в растворе дезинфектанта полученную смесь переносят в предварительно внесенный в лунки планшеты и высушенный в них нейтрализатор дезинфектантов, выдерживают ее в течение 30 мин и переносят в лунки, содержащие предварительно высушенную в них питательную среду с редокс-индикатором.