СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ИЗ ВОДОРОСЛИ GRACILARIA VERRUCOZA Российский патент 2010 года по МПК A61K36/04 C07C405/00 

Изобретение относится к способам получения простагландинов из морских культивируемых агароносных красных водорослей, в частности из Gracilaria verrucoza, и может быть использовано для получения фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов, содержащих комплекс простагландинов и предназначенных для использования в комплексной терапии социально-значимых заболеваний.

В литературе имеется множество публикаций, посвященных простагландинам или простаноидам (PGs). Термин простаноиды является международным непатентуемым названием природных и синтетических простагландинов и простагландинподобных соединений, относительно которых известно, что даже незначительные изменения в химической структуре или стереохимической конфигурации оказывают существенное влияние на их биологическую активность. Эти соединения широко используются для профилактики и лечения различных видов заболеваний. Однако большинство известных способов относятся к получению синтетических простагландинов.

Известен способ получения простагландина Е₂ (ПГЕ₂) из свежесобранной водоросли, согласно которому водоросль помещают в емкость с дистиллированной водой на 20 час при комнатной температуре. Затем воду сливают, а водоросль промывают метанолом. Растворы объединяют и добавляют этилацетат до расслоения слоев этилацетата и воды. Слой этилацетата сливают и пропускают через колонку с сухим силикагелем. Простагландины элюируют с колонки смесью дихлорметана и метанола, а затем полученную фракцию разделяют на двух сорбентах (N.Fosetani and Hashimoto K. "Prostaglandin E2: Candidate for causative agent of "Ogonori" poisoning". Bulletin of the Japan Society of Scientific Fisheries, 1984, 50(3), 465-469).

Недостатками известного способа являются:

1. длительное время первичной инкубации в воде, что вызывает выход полисахаридов в водную фазу, а добавление этилацетата к водной фазе приводит к образованию стойких эмульсий, в результате часть активного вещества (простагландинов) может теряться, сорбируясь на границе раздела фаз полисахарид-вода-этилацетат;

2. стадия концентрирования на колонке с сухим силикагелем может вызывать процесс перехода биологически активного ПГЕ₂ в ПГА₂, не обладающего биологической активностью. В вышеупомянутой статье авторы показали, что количество ПГА₂ при выделении превышало количество ПГЕ₂;

3. проведение очистки в три стадии осложняет, удорожает и удлиняет процесс получения простагландинов.

Наиболее близким способом по количеству существенных признаков и достигаемому техническому результату является способ получения простагландинов из водоросли Gracilaria verrucoza. Согласно данному способу водоросль измельчают на кусочки или клетки физическими или химическими методами, в частности с использованием лиофильной сушки и гомогенизации, вымораживания, разрезания на кусочки, разрушения клеток ультразвуком. Измельченную водоросль или ее порошок смешивают с дистиллированной водой или водоорганическим растворителем и выдерживают смесь при температуре 5-40°С и рН 3-12 в течение ночи для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в водорослях, в простагландины и перехода их в дистиллированную воду или органический растворитель. В случае использования для извлечения простагландинов воды их затем переводят в органическую фазу, используя в качестве органического растворителя, в частности тетрагидрофуран, этилацетат, этиловый эфир, петролейный эфир, н-гексан, хлороформ, четыреххлористый углерод, метиленхлорид или бензин. Полученный раствор пропускают через неполярную синтетическую пористую смолу, имеющую специфическую поверхность не менее 350 м²/г, с объемом пор не менее 0,8 мл/г, при этом простагландины сорбируются на этой смоле, с которой они затем элюируются органическим или водоорганическим растворителем. Полученная смесь простагландинов (ПГЕ₁, ПГЕ₂, ПГЕ₃ и ПГF_2α) разделяется на индивидуальные простагландины известными методами жидкостной хроматографии (ЕР №0424915, С07С 405/00, С07С 67/00, С07С 401/00, 02.05.91 г.).

К недостаткам известного способа следует отнести следующее:

- предварительная обработка сырья физическими или химическими методами приводит к частичному разрушению ферментных систем, присутствующих в водоросли, и, как следствие, снижению выхода простагландинов;

- необходимость измельчения исходного сырья приводит к усложнению самого способа;

- длительность процесса получения простагландинов. Так, процесс превращения ненасыщенных жирных кислот проходит в течение ночи, т.е. не менее 8-10 часов, при этом в течение этого периода необходимо постоянно поддерживать определенную температуру (5-40°С) и рН в интервале 3-12, что значительно усложняет технологический процесс;

- длительное выдерживание в воде приводит к повышенному выделению полисахаридов, которые за счет образования эмульсий затрудняют процесс последующей экстракции простагландинов органическими растворителями;

- необходимость экстракции простагландинов органическими растворителями. Эта стадия является трудоемкой и не обеспечивает достаточной степени перехода простагландинов из водной фазы в органическую фазу;

- недостаточная емкость неполярной синтетической пористой смолы, используемой для извлечения простагландинов из раствора, что требует использования значительного количества сорбента и соответственно больших количеств органических растворителей для элюирования.

Задача, поставленная перед изобретением, - повышение выхода простагландинов и упрощение способа.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения простагландинов из водоросли Gracilaria verrucoza, включающем инкубацию водоросли в дистиллированной воде для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в этой водоросли, в простагландины, переход простагландинов в дистиллированную воду, извлечение простагландинов из водного раствора сорбцией на сорбенте с последующим элюированием водоорганическими растворителями, согласно изобретению, в качестве исходного сырья используют свежесобранную водоросль, инкубацию в дистиллированной воде ведут в течение 1-3 час при освещении и температуре не более 4°С. Перед извлечением простагландинов сорбцией на сорбенте полученный водный раствор подкисляют до рН 2,5-3,0. В качестве сорбента используют неполярный модифицированный силикагель с привитыми углеводородами с размером зерен до 100 мкм.

Использование в качестве сырья свежесобранной водоросли не только приводит к упрощению способа, поскольку отсутствует необходимость замораживания и измельчения сырья, но и способствует увеличению выхода простагландинов.

Проведение инкубации свежесобранных морских водорослей при освещении также значительно повышает выход простагландинов. При этом целесообразно освещать водоросли светом интенсивностью 100-300 mkE/m²s. При использовании света интенсивностью менее 100 mkE/m²s увеличение выхода простагландинов не наблюдается, а при использовании света интенсивностью более 300 mkE/m²s происходит подавление ферментативной активности, что отрицательно сказывается на выходе целевого продукта.

Установлено, что процесс превращения ненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой кислоты, в простагландины под воздействием ферментов наилучшим образом проходит при температуре среды не более 4°С, обеспечивая, в конечном результате, повышение выхода простагландинов. Повышение температуры более 4°С приводит к снижению выхода простагландинов.

Инкубация морской водоросли в дистиллированной (пресной) воде менее 1 час не обеспечивает в полной мере переход ненасыщенных жирных кислот в простагландины. Увеличение времени инкубации более 3 час приводит к нежелательным последствиям. Так, при этом начинается интенсивный переход в раствор полисахаридов, присутствующих в водорослях. Полисахариды образуют эмульсию, что, в последующем, затрудняет выделение простагландинов на сорбенте, т.е. осложняется процесс очистки, и, как следствие, уменьшается выход простагландинов.

Подкисление водного раствора, содержащего простагландины, до рН среды 2,5-3,0 обеспечивает перевод простагландинов, находящихся в воде в виде солей, в форму свободных ионизированных кислот. Это способствует наилучшему удержанию простагландинов на силикагеле и, в конечном результате, повышает выход простагландинов. При повышении кислотности среды, рН ниже 2,5, наблюдается нежелательный переход биологически активной формы простагландина ПГЕ₂ в неактивную форму ПГА₂.

В качестве сорбента целесообразно использовать неполярный модифицированный силикагель с привитыми углеводородами с размером зерен до 100 мкм. В качестве привитых углеводородов могут быть углеводороды с длиной цепи от С₁₂ до C₁₈. Эти сорбенты обладают по сравнению с ионообменными смолами, используемыми в прототипе, емкостью выше на 2-3 порядка, что позволяет перерабатывать значительные объемы раствора, обеспечивает быстрое и качественное извлечение простагландинов и позволяет отказаться от стадии предварительного концентрирования простагландинов в органических растворителях перед их разделением на сорбенте.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1.

Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 100 mkE/m²s в течение 3 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н соляной кислотой до рН 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (C₁₈, содержащий 9-12% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ_2α (4,75 мин) и ПГЕ₂ (5,28 мин). Получено ПГЕ₂ - 519 мкг/г сырой водоросли и ПГФ2_α - 215 мкг/г сырой водоросли. Структура полученных веществ подтверждалась методами газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Пример 2.

Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 mkE/m²s в течение 2 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н соляной кислотой до рН 2,5 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (C₁₈, содержащий 16-18% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ_2α (4,75 мин) и ПГЕ₂ (5,28 мин). Получено ПГЕ₂ - 659 мкг/г сырой водоросли и ПГФ_2α - 255 мкг/г сырой водоросли.

Пример 3.

Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 300 mkE/m²s в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н соляной кислотой до рН 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (C₁₈, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 50 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ_2α (4,75 мин) и ПГЕ₂ (5,28 мин). Получено ПГЕ₂ - 475 мкг/г сырой водоросли и ПГФ_2α - 164 мкг/г сырой водоросли.

Пример 4.

Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 300 mkE/m²s в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2 н соляной кислотой до рН 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С₁₂, содержащий 20% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл ацетона. В ацетон элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата ацетон удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ_2α (4,75 мин) и ПГЕ₂ (5,28 мин). Получено ПГЕ₂ - 480 мкг/г сырой водоросли и ПГФ_2α - 185 мкг/г сырой водоросли.

Пример 5.

Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 300 mkE/m²s в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н соляной кислотой до рН 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С₁₈, содержащий 16-18% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл ацетонитрила. В ацетонитрил элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата ацетонитрил удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ_2α (4,75 мин) и ПГЕ₂ (5,28 мин). Получено ПГЕ₂ - 566 мкг/г сырой водоросли и ПГФ_2α - 262 мкг/г сырой водоросли.

Как видно из представленных примеров, заявляемый способ позволяет повысить выход простагландинов по сравнению с прототипом более чем на 30%. Кроме того, предложенный метод позволяет существенно упростить процедуру выделения простагландинов из инкубационной среды и отказаться от использования значительного количества органических растворителей.

Изобретение относится к фармацевтике. Водоросли Gracilaria verrucoza инкубируют в дистиллированной воде для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в водоросли, в простагландины. Переводят простагландины в дистиллированную воду. Проводят извлечение простагландинов из водного раствора сорбцией с последующим элюированием водоорганическими растворителями. Используют свежесобранную водоросль, инкубацию ведут в течение 1-3 час. при освещении светом интенсивностью 100-300 mkE/m²s и температуре не более 4°С, перед извлечением простагландинов сорбцией полученный водный раствор подкисляют до рН 2,5-3,0, при этом в качестве сорбента используют неполярный модифицированный силикагель с привитыми углеводородами с размером зерен до 100 мкм. Изобретение позволяет повысить выход продукта и упростить процесс.

Способ получения простагландинов из водоросли Gracilaria verrucoza, включающий инкубацию водоросли в дистиллированной воде для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в этой водоросли, в простагландины, переход простагландинов в дистиллированную воду, извлечение простагландинов из водного раствора сорбцией на сорбенте с последующим элюированием водоорганическими растворителями, отличающийся тем, что используют свежесобранную водоросль, инкубацию ведут в течение 1-3 ч при освещении светом интенсивностью 100-300 mkE/m²s и температуре не более 4°С, перед извлечением простагландинов сорбцией на сорбенте полученный водный раствор подкисляют до рН 2,5-3,0 при этом в качестве сорбента используют неполярный модифицированный силикагель с привитыми углеводородами с размером зерен до 100 мкм.