ИММУНОРЕАКТИВНЫЙ ПЕПТИД И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2010 года по МПК C07C7/08 A61K38/10 A61P19/02 

Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина. Изобретение относится также к способу детекции аутоиммунных антител при ревматоидном артрите путем взаимодействия с аутоиммунными антителами от пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее распространенных заболеваний человека. Этим заболеванием по данным ВОЗ страдает 1-2% населения Земли. В России официально зарегистрировано более 1 млн больных РА. РА характеризуется хроническим воспалением суставов. Это приводит к страданиям, ухудшению качества жизни, снижению и потере трудоспособности.

Развитие РА характеризуется чрезвычайным многообразием клинических проявлений и биохимических нарушений. Это существенно затрудняет раннюю диагностику, а следовательно, проведение адекватной терапии, которая особенно эффективна в дебюте болезни. Современная диагностика РА основана на клинических проявлениях заболевания в сочетании с лабораторным определением в крови пациента так называемого ревматоидного фактора (РФ). Однако РФ не является достаточно специфичным маркером. Двумя другими серологическими маркерами РА являются антиперинуклеарный фактор (АПФ) и антикератиновые антитела (АКА), распознающие антигенные детерминанты цитруллинсодержащего белка филаггрина. Несмотря на высокую специфичность АПФ и АКА для диагностики РА эти аутоантитела не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей. В последние годы был разработан иммуноферментный (ИФА) метод определения антител к филаггрину (АФ), который обладает высокой специфичностью. АФ обнаруживаются в крови еще до появления клинических признаков РА, что демонстрирует важную роль этих антител в патогенезе этого заболевания и возможность проводить раннюю диагностику по этому показателю. Основой этой методики является антигенный комплекс в виде полипептидов (участков молекулы филаггрина) или сам белок (рекомбинантный).

Из предшествующего уровня техники известны пептиды, которые используются в способе диагностики ревматоидного артрита и описаны US 2004241767, US 2004253644, US 6890720, US 7288634, US 6858438.

Изобретение посвящено созданию нового антигенного комплекса, обладающего большей специфичностью и чувствительностью.

Исходя из теории гетерогенности популяции АФ, отражающей природную вариабельность антигенов, на которые они вырабатываются (наличие АПФ, АКА, АФ), и полиморфизма молекулы филаггрина можно предположить, что существует несколько цитрулинизированных структурных участков этой молекулы, обладающих антигенными свойствами. Компьютерный анализ молекулы подтвердил это.

На основе предсказательного анализа антигенных эпитопов твердофазным методом с использованием f-moc техники было синтезировано четыре пептида, воспроизводящих фрагменты молекулы белка филаггрина: Ф-1, Ф-2, Ф-3, Ф-4.

ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ - Ф-1,

CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ - Ф-2,

QSHQESAXGXSGETSGHSGS - Ф-3,

CSHQESAXGXSGETSCHSGS - Ф-4,

где Х - Cit,

которые иммунологически реактивны в иммунологическом исследовании, направленном на выявление РА, и могут применяться в способе диагностики РА, включающей в себя детекцию аутоиммунных антител в сыворотке пациента, путем взаимодействия, по крайней мере, одного из вышеуказанных пептидов с сывороткой пациента и детекции наличия сформированных комплексов между упомянутым пептидом и антителом.

Все препараты пептидов соответствовали 95% чистоте по данным ВЭЖХ и масс-спектроскопии и содержали 20 амикислот с заменой двух остатков Arg на Cit.

ИФА-методика измерения антигенной активности пептидов по отношению к АФ.

1. Иммобилизация ИФА-планшет.

На полистироловые планшеты (Costar США) наносили растворы пептидов в 0,01 М карбонатно-фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 1 мкг/100 мкл. В каждую лунку планшета вносили 100 мкл раствора. Сорбцию пептида проводили при 2-4°С в течение 16 часов.

По окончании сорбции раствор пептида стряхивали и в каждую лунку вносили 2% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США). Инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.

2. Проведение анализа и детекция иммунных комплексов (антиген-антитело).

Исследуемые пробы разводили в 100 раз раствором 2% БСА и полученный раствор вносили в лунки по 100 мкл. Инкубировали 1,5 часа при 37°С. По окончании инкубации планшет промывали трехкратно фосфатно-солевым раствором с 0,05% твин-20 (ФСР) по 250 мкл в лунку. Затем для образования специфических иммунных комплексов в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (1:1000) конъюгата IgG антител кролика к IgG человека с пероксидазой хрена или конъюгат белка А с пероксидазой хрена в 2% БСА и инкубировали 1 час при 37°С. После инкубации раствор стряхивали и планшет промывали трижды раствором ФСР. Для осуществления детекции иммунных комплексов в каждую лунку вносили 100 мкл раствора ТМБ с гидроперитом и инкубировали в темноте при комнатной температуре 5-15 мин до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 50% соляной кислоты. Интенсивность окраски измеряли на фотометре вертикального сканирования при 450 нм. Положительными считали сыворотки, у которых величина оптической плотности (ОП) превышала значение 0,2.

При испытании иммунохимических свойств пептидов Ф-3 и Ф-4 выявили их высокую чувствительность по отношению АФ (таблицы 2, 3).

Таблица 2 Выявление антител к филаггрину (пептид Ф-3, Ф-4) в сыворотках больных РА   Общее количество Выявлено больных с AT к Ф-3 Выявлено больных с AT к Ф-4 Больные РА 78 66 73 Чувствительность   85% 93,6%

При сравнении иммунохимических свойств Ф-3 и Ф-4 между собой и со свойствами уже известного активного циклического пептида ЦЦП (HQCHQESTXGRSRCGRSGS, где X-Cit) оказалось, что есть пациенты, у которых АФ определяются одним из этих пептидов, а другим нет. Наибольшей чувствительностью обладает Ф-4 (Таблица 3, чертеж). На основе этих данных создается антигенный комплекс для выявления АФ из смеси пептидов (Ф-3; Ф-4).

Таблица 3 Данные измерения оптической плотности образцов сыворотки доноров и больных РА Пациенты ЦЦП(ОП_{450 нм}) Ф-3(ОП_{450 нм}) Ф-4 (ОП₄₅₀) 1 0,147 0,239 0,329 0,333 0,791 2 2,136 0,241 0,525 0,309 0,329 3 0,222 0,258 0,61 0,349 0,525 4 0,28 0,242 0,276 0,271 0,61 5 0,463 0,197 0,295 0,264 0,276 6 0,401 0,217 0,588 0,187 0,295 7 0,743 0,339 0,56 0,283 0,588 8 0,224 0,27 0,342 0,411 0,56 9 0,206 0,251 0,393 0,32 0,342 10 0,972 0,223 0,469 0,274 0,393 11 0,209 0,21 0,861 0,193 0,469 12 0,263 0,229 0,641 0,249 0,861 13 0,364 0,232 0,291 0,233 0,641 14 0,395 0,215 0,101 0,243 0,291 15 0,476 0,245 0,279 0,209 0,101 16 0,331 0,3 0,243 0,403 0,279 17 0,16 0,263 0,31 0,259 0,243 18 0,304 0,21 0,347 0,243 0,31 19 0,195 0,215 0,437 0,266 0,347 20 0,192 0,191 0,711 0,188 0,437 21 0,274 0,203 0,172 0,175 0,711 22 0,626 0,255 0,273 0,202 0,172 23 0,294 0,184 0,323 0,198 0,273 24 0,184 0,221 0,276 0,218 0,323 25 0,272 0,31 0,465 0,184 0,276 26 0,2 0,234 0,472 0,334 0,465 27 0,166 0,217 0,421 0,212 0,472 28 0,158 0,18 0,516 0,316 0,421 29 0,223 0,236 0,255 0,249 0,516 30 0,253 0,161 0,213 0,197 0,255 31 0,357 0,229 0,306 0,23 0,213 32 0,154 1,548 0,251 0,204 0,306 33 1,024 1,334 0,441 0,177 0,251 34 0,17 0,221 0,849 0,366 0,441 Д1 0,117 0,168 0,123 0,135 0,08 Д2 0,122 0,135 0,118 0,165 0,216 Д3 0,084 0,139 0,174 0,173 0,219 Д4 0,105 0,093 0,105 0,131 - Д5 0,145 0,114 0,115 0,083 - Д6 0,115 0,099 0,102 0,114 - Д7 0,103 0,117 0,109 0,091 - Д8 0,104 0,112 0,116 0,119 - Примечание: в графе «пациенты» индексом «Д» помечены сыворотки доноров.

Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами, используемым для диагностики ревматоидного артрита. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина и имеющие аминокислотные последовательности, представленные в формуле изобретения. Изобретение раскрывает способ диагностики ревматоидного артрита путем выявления аутоиммунных антител с использованием указанного пептида(ов) путем взаимодействия последнего(их) с сывороткой крови пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Присутствие аутоиммунных антител в исследуемом образце диагносцируют по наличию сформированных комплексов пептида с антителом. Пептид по изобретению обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. Пептид, имеющий аминокислотную последовательность и структуру, выбранную из:
ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ,
CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ,
QSHQESAXGXSGETSGHSGS,
CSHQESAXGXSGETSCHSGS,
где Х - Cit, предназначенный для диагностики ревматоидного артрита.

2. Пептид по п.1, иммунологически реактивный в иммунологическом исследовании, направленном на выявление ревматоидного артрита.

3. Способ диагностики ревматоидного артрита, включающий взаимодействие по меньшей мере одного из пептидов по п.1 или смеси пептидов, представленных в п.1, с сывороткой (плазмой) крови больного и диагностирование ревматоидного артрита по наличию сформированных комплексов между пептидом и антителом.

4. Способ по п.3, в котором детектирование включает использование иммуноферментного анализа (ИФА).