Питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной палочки Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/04 

сп

si

4i

hO Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в клинических и научных (генетических) исследова1шях. Известна среда Чистовича для определения лецитиназной активности кокков, содер-жащая мясопептонный агар и яичный желток 1 Известна питательная среда для определения лецитиназной активности псевдомонад, со держащая пептон Na2HPO4, КН2РО4, яичный желток, Мд5О4, глюкозу, агар и воду 12. Однако известные среды не позволяют опр делить лецитиназнзао активность синегнойной палочки. Известна такж питательная среда для определения ледитиназной активности синёгаойной палочки, содержащая кальций хлористый, мапшй сернокислый, натрий хлористый, агар, дистиллированную воду, а также калий фосфорнокислый однозамещеиный, глутаминовую кислоту и альфа-аланин {3. данная среда не обеспечивает быстроты и 1 ростоты определения, так как фермента достаточно не накопляется и для ег определения необходимо выполнить ряд допол нительных приемов: смьш выросших микроор ганизмов, центрифугирование, определение активности лецитинйзы путем титрования раство ра, что требует дополнительного времени и труда. Целью изобрете}шя является ускорение и упрощение определения. Эта цель достигается тем, что питательная среда ДД1Я определения лецитиназной активности сипегнойной палочки, содержащая кальций .хлористый,. магний сернокислый, натрий хлористый, агар и дистиллированную воду, допол нительно содержит натрий двууглекислый и яич1П 1Й желток при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: 0,05-0,15 Кальций хлористый MarHut б риокис0,05-0,15 4,75-5,15 Натрий хлористьш Натрий двууглекис0,05-0,15 лый 20,0-30,0 Яичный 51селток 12,0-20,0 Питательную среду готовят следующим образом. Готовят раздельно растворы солей, смешивают их с расплавленным агаром и перед упот реблением в состав среды вводят желток в в де э:лупъс№1. Введение эмульсии желтка прово дят в агаризованную среду, имеющую темпера туру не выше 50С. Среду разливают в чашки и охлаждают. В тех случаях, когда предполагается опреде ление, лещгашазной активности (например, пр генетических исследованиях) штаммов синегнойной палочки, требующих для своего развития определенных компонентов (аминокислот, витаминов и др.), компоненты также могут быть дополнительно введены в состав среды. Пример 1. Готовят среду следующего состава, г/л: Кальций хлористый Магний сернокислый Натрий двууглекислый Натрий хлористый Яичный желток 20,00 (удельный вес принимают за 1) Агар-агар 12,00 Вода дистиллировандо 1 л. ная Для приготовления cpeJEUJ предварительно отвешивают на технических весах хлористый кальций, сернокислый магний, двууглекислый натрий, хлористый натрий и агар-агар в указанных количествах и растворяют их при постоянном помешивании, нагревая среду до расплавления агара. Затем рН среды доводят до 7,4 и разливают ее по емкостям. Стерилизацию осуществляют автоклавированием при в течение 15 мин. Ири работе с ауксотрофными штаммами до заполнения чашек Петри соответствующие . аминокислоты в виде стерильных растворов вносят в среду в количестве 0,02 г/л. Так, . для .штамма РАО ML 4262 синегнойной палочки в среду вносят гистидин, триптофан, метионин, изолейцин и валин, а для штамма . BS 250 PS. рв11с1э-триптофан. Затем к расплавленной и охлажденной до 50° С солевой основе, добавляют эмульсий яичного желтка (смесь равных объемов желтка и физиологического раствора) в количестве 20 г/л, среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри (15-20 мЛ). Чашки подсуингвают при 37°С в течение 40 мин. Чашки с этлульсией желтка готовят непосредственно перед опытом. Пригатовле1шые указанным способом чашки засевают штаммами РАО ML 4262 и PS. put Ida BS 250, для чего на поверхность среды культуры наносят петлей (штрихом) или пипеткой в виде капель в количестве 10 -5x10 клеток. Через 48 ч инкубации при оптимальной температуре (синегнойную палочку инкубируют при 37°С, а Ps. putida - при ) вокруг колошей синегнойной палочки появлялись ореолы, имеющие вид двухконтурного кольца: внутренний - матовый с металлическим блеском и внеиший - прозрачный. 31 Появление ореолов свидетельствует о нали-i чии лецитиназной активности у исследуемой культуры. В чашках с культурой Ps. putida ореола вокруг колоний не наблюдается, из че го можно сделать вывод об отсутствии лецитиназной активности у исследуемого организЧеткое различие в морфологии колоний, регистрируемое визуально, позволяет дифферен {Шровать синегнойную папочку от некоторых иепатогенных псевдомонад. Пример 2. Готовят среду следующе го состава, г/л: Кальций хлористый0,15 Магний сернокислый 0,15 Натрий двууглекислый 0,15 Натрий хлористый0,15 Яичный желток30,00 Агар-агар20,00 Вода дистиллированная до 1 л рН среды7,2 Технические приемы для приготовления чашек Петри со средой такие же, как и в пр№ мере 1. Одаако до добавления змульсии желт ка к одной порции среды до&1вляют амиНокислоты, соответствующие питательным потреб ностям штамма ОА-87 (аргинин, гистидан. лейцин, пролин), и витамин Bj. Кб второй порции среды аминокислоты и витамин BI не прибавляют, поскольку она предназначена для выращивания прототрофного штамма синегной ной папочки,- Рост кишечной палочки на среде с добавками аминокислот и сИнегнойной палочки на среде, содержащей лишь эмульсию желтка, отмечался уже через 2 сут после посева 2x10 клеток (инкубация в обоих случаях проводилась Я1да температуре 37 С), по образовюте. двухконт)фных ореолов вокруг коло ний отмечалось только на среде, йнокулироt ванной СИнегнойной палочкой. П р и м ер 3. На среду с аминокисло;1ами и витамином Bj (согласно примеру 2) сеют одновременно культуры кишечной и си.иегнойпой палочек (смесь содержала примерно по 100 клеток каждого вида бактерий). Через 48 ч выращивания при 37° С отбирают по 10 колоний с двухконтурным ореолом и без него. Об1§епринятый анализ культураль но-биохимических свойств показал, что все {КОЛОНИИ с ореолами принадлежали синегнойной палочке, а колонии, которые лецитин не 2 расщепляли (т.е. не давали ореолов), образованы кишечной палочкой.| Пример 4. Готовят солевую среду с добавлением змульсии желтка (без добавления аминокислот). На среду высевают прототрофный ппамм СИнегнойной палочки и штамм о, А-87 кишечной палочки, нуждающийся в дополнительных факторах шпгания. Солевую среду с змульсией желтка засевают с помощью пипетки (каплями) смесью отмытых ночных культур обеих видов бактерий. Через 48 ч на среде четко заметны коло НИИ СИнегнойной палочки, окруженные;, двухконтурными зонами. Свидетельствующими о расщеплении. лецитина. Кищечная палочка роста не дает (при посеве очень rjrcTbix суспензий смешанных культур иногда появляются единичные колонии кишечной палочки но ореолов вокругх них никогда не отмечалось). Прим е.р 5. Солевая ореда с эмульсией желтка может быть использована также для выявления мутантов синегнойной палочки, лишенных лецитиназной активности. В качестве объекта исследования используют штамм 4262 и к среде добавляют ами нокислоты, соответствующие его питательным потребностям (см. пример 1). Мутагенез о уществляют с помощью нитрозогуанида. Из 324 колоний штамма РАОмЬ 4262 обнаружена одаа крло1а1я без двухконтурного ореола. Последующий рассев клеток этой колонии на солевой среде с эмульсией желтка .и амино- кислотами подтвердил, что это лецитиназонегативный мутант. Результаты определения лещгпшазвой актив- ности исследуелши культур приведены в таблице. Использование питательной позволяет быстро и просто определять лецитиназную активность синегнойной палочки, причем определение можно осуществлять визуально. Питательная среда делает возможным определение лецитиназной активности клинических штаммов синегнойной палошси с целью оп ределения степени их патогенности, изучение генетических особенностей этого, возбудителя, а также дифференциащга штаммов синегнойной. палочки от лецитиназоотрицательных псев- . домонад (например, Ps. putida), встречающижся в одном и том же клиническом материале. Прим е гамяе: Цифры в таблице означают число выросших колоний на чашке; наличие леш1тнназной активности; - отсутствие лецитиназной активности.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛВЦИГШ1АЗНОЙ АКТИЮЮСТИ СИНЕЩОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, содержащая кальций хлористый, магний серноквслый, натрий хлористый, агар, диспшлированную воду, о тл н ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения и упрощения определения, она дополнительно содержит натрий двууглекисльп} и яичный желток при следующем соопюшении компонентов, г/л дастиллированной воды: Кальций хлористый0,05-0,15 Магний сернокислый 0/)5-d,I5 Натрий хлс сгьга4,75-5,15 Натрий двууглекислый0,05-0,15 § чикА желток20,0-30,0 ,0-20.0 (Л