Селективная питательная среда для выделения аэромонад из водных объектов Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к области микробиологии, более конкретно к сфере санитарной микробиологии и может быть использовано учреждениями, осуществляющими надзор и контроль качества воды сточных, питьевых вод и поверхностных водоемов, в том числе имеющих рыбохозяйственное значение.

Известен способ выделения и идентификации аэромонад с использованием питательных сред А1 и А2, в соответствии с рекомендациями «Методы исследований объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады» (Методы исследования объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады: Метод. рекомендации / М-во здравоохранения РСФСР, Гл. упр. н.-и. ин-тов и координации науч. исслед.; [Составители Г. П. Калина, Т. И. Графова]. - М. : Б. и., 1980. - 11 с), разработанные в Московском научно-исследовательском институте гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, и методическими указаниями по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов (Методические указания по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов Методические указания Минсельхоза России от 27.09.1999 № 13-4-2/1742).

Жидкая среда накопления А-1 имеет следующий состав (г/л):

Магния сульфат 0,2 Крахмал растворимый 2 Желатин 10 Калия гидрофосфат 1 Водный раствор кристаллического фиолетового 0,01% 20 см³ pH 7,2 - 7,4 Стерилизация 112 +/- 1 в течение 15 мин

Селективность среды А-1 обусловлена действием кристаллического фиолетового в отношении большинства грамположительных бактерий.

Известна питательная среда для обнаружения аэромонад по авторскому свидетельству SU № 544674 от 24.07.1975 на изобретение. Питательная среда для обнаружения аэромонад в объектах окружающей среды, содержащая крахмал и дистиллированную воду, причем с целью ускорения процесса выращивания аэромонад, она дополнительно содержит натрий-аммоний фосфорнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, кристаллический фиолетовый и все ингредиенты взяты в следующих соотношениях, вес. %:

Натрий-аммоний фосфорнокислый 0,1-0,2 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,1 Магния сульфат 0,01-0,03 Крахмал 0,5-1,5 Кристаллический фиолетовый 0,0002-0,00025 Дистиллированная вода Остальное

При выращивании аэромонад в этой среде почти полностью отсутствует рост посторонней микрофлоры. Недостатком среды для выделения аэромонад является наличие в составе только одного источника питательных веществ (крахмала), кроме того отмечается слабое подавление роста энтеробактеров и энтерококков, а при высоком фекальном загрязнении воды может наблюдаться рост кишечной палочки.

Задача заявленного изобретения состояла в разработке жидкой питательной среды для выделения аэромонад из воды, которая смогла бы обеспечить достаточный рост бактерий рода Aeromonas при полном подавлении эшерихий, сальмонелл, стафилококков и энтерококков. Технический результат заключается в повышении накопительных и селективных свойств среды для выделения аэромонад из водных объектов. Данный технический результат достигается за счет всей совокупности предложенных компонентов среды.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная селективная среда для выделения аэромонад из водных объектов содержит пептон, экстракт кормовых дрожжей, аргинин, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, хлорид натрия, дезоксихолат, гидроксид натрия, бромтимоловый синий, тимоловый синий, ампициллин и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пептон ферментативный 10 Экстракт кормовых дрожжей 3 L-аргинин солянокислый 3,5 Натрий хлорид 9 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Магния сульфат 0,2 Дезоксихолат натрия 2 Гидроксид натрия 0,35±0,05 Бромтимоловый синий 0,03 Тимоловый синий 0,03 Ампициллин 0,005 Дистиллированная вода до 1000 мл

Бактерии рода Aeromonas относятся к семейству Aeromonadaceae. Это факультативно-анаэробные грамотрицательные палочки, чаще подвижные, оксидазоположительные и каталазоположительные. По сбраживанию углеводов, образованию сероводорода и гидролиза мочевины отмечается вариация признаков. В естественных условиях они способны размножаться при температуре от 4°С до 45°С, а также при pH среды от 4,5 до 9,8. Аэромонады широко распространены в пресных и соленых водоемах, могут обнаруживаться в сточных водах, донных отложениях и в микрофлоре гидробионтов. Cреди них имеются виды патогенные для морских, пресноводных рыб, земноводных и пресмыкающихся. Поскольку рыбохозяйственные водоемы часто располагаются вблизи населенных пунктов и сельскохозяйственных предприятий, в них поступают различные стоки (коммунальные, животноводческие и др.), что приводит к бактериальному загрязнению вод, результатом которого является эпизоотическое неблагополучие водных объектов. Некоторые из видов аэромонад могут инициировать заболевания человека, связанные как с водным, так и с алиментарным фактором. Аэромонады известны как микроорганизмы образующие обширные колонии в системах водоснабжения. Имеются сведения об обнаружении этих бактерий в системах распределения водопроводной воды, прошедшей систему водоподготовки и в биопленках распределительных систем, где могут быть устойчивыми к хлорированию. В связи с вышеизложенным проводится анализ воды, включающий индикацию и количественный учет бактерий рода Aeromonas. В качестве основного источника азота в предлагаемой среде используется пептон, в качестве факторов роста - экстракт кормовых дрожжей и L-аргинин солянокислый, для придания изотонических свойств среды - хлорид натрия, в качестве фосфатного буфера - калий фосфорнокислый однозамещенный и кофактора для различных метаболических реакций - сульфат магния, селективными факторами являются дезоксихолат натрия и ампициллин, индикаторами - бромтимоловый синий, тимоловый синий и дистиллированная вода при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пептон ферментативный 10 г 34,35 % Экстракт кормовых дрожжей 3 г 10,30 % L-аргинин солянокислый 3,5 г 12,02 % Натрий хлорид 9 г 30,91 % Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 г 3,43 % Магния сульфат 0,2 г 0,69 % Дезоксихолат натрия 2 г 6,87 % Гидроксид натрия 0,35±0,05 г 1,21 % Бромтимоловый синий 0,03 г 0,10 % Тимоловый синий 0,03 г 0,10 % Ампициллин 0,005 г 0,02 % Дистиллированная вода до 1000 мл рН 8,3±0,2 при 25°С

Внесение в питательную среду дезоксихолата натрия способствует ингибиции грамположительных бактерий. Добавление ампициллина полностью подавляет рост сальмонелл, кишечной палочки и чувствительные к нему энтерококки, тем самым создаются благоприятные условия для роста аэромонад. Высокая щелочность среды (рН 8,3±0,2) способствует подавлению роста энтеробактерий и синегнойных палочек. При действии аргининдегидролазы аэромонад на L-аргинин среды образуются щелочные продукты реакции, которые изменяют окраску среды с исходного зеленого на голубой.

Подбор концентраций ингредиентов в составе предлагаемой питательной среды для аэромонад, при использовании разных концентраций пептона, экстракта кормовых дрожжей, L-аргинина солянокислого, дезоксихолата натрия, ампициллина и индикаторов (таблица 2).

Таблица 2 Состав питательной среды в г/л: 1 вариант 2 вариант 3 вариант Пептон ферментативный 5,0 10,0 10,0 Экстракт кормовых дрожжей 1,0 3,0 3,0 L-аргинин солянокислый 2,0 3,5 3,5 Натрий хлорид 9,0 9,0 9,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0 1,0 1,0 Магния сульфат 0,2 0,2 0,2 Дезоксихолат натрия 3,0 2,5 2,0 Гидроксид натрия 0,22±0,05 0,35±0,05 0,35±0,05 Бромтимоловый синий 0,03 0,03 0,03 Тимоловый синий - - 0,03 Ампициллин - - 0,005 рH при 25°С 7,4±0,2 8,3±0,2 8,3±0,2

При подборе концентраций ингредиентов использовали тест-штаммы: Pseudomonas aeruginosa 10145; Salmonella paratyphi B 506; E. coli 3912/41; Staphylococcus aureus 6538; Enterococcus faecalis 29212, Aeromonas caviae ВКШМ-Б-297М; Aeromonas veronii ВКШМ-Б-307М; Aeromonas hydrophila ВКШМ-Б-301М, Aeromonas salmonicida ВКШМ-Б-307М. Для приготовления микробных взвесей суточные агаровые культуры тест-штаммов смывают 0,9 % стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, доводят взвеси до 10 ед. по оптическому стандарту мутности, что соответствует 10⁹ микробных клеток в 1 мл. Затем серийными десятикратными разведениями доводят до содержания 100 тыс. (10^-4), 10 тыс. (10^-5), 1 тыс. (10^-6), 100 (10^-7), 10 (10^-8) и 1 (10^-9) микробных клеток в 1 мл взвеси. Высев производят из каждого разведения по 1 мл в 9 мл опытной среды (варианты среды 1-3) в трех повторностях и инкубируют при температуре 28±2°С в течение 18-24 час. Высев производят из пробирок с вариантами опытных сред, в которых наблюдался рост бактерий, на чашки с питательными средами (рыбо-пептонный агар, Эндо агар, кровяной агар).

Данные по ростовым свойствам среды представлены в таблицах 3 и 4.

Taблица 3 Зависимость роста тест-штаммов микроорганизмов от концентрации ингредиентов в опытной среде Микроорганизмы Разведения Варианты опытной среды 1 2 3 P. aeruginosa 10^-1 + + + 10^-2 + - - 10^-3 - - - 10^-4 - - - S. paratyphi B 10^-1 + + - 10^-2 + + - 10^-3 + - - 10^-4 + - - E. coli 10^-1 + + - 10^-2 + + - 10^-3 + - - 10^-4 - - - S. aureus 10^-1 - - - 10^-2 - - - 10^-3 - - - 10^-4 - - - E. faecalis 10^-1 + + - 10^-2 - - - 10^-3 - - - 10^-4 - - -

Taблица 4 Зависимость роста аэромонад от концентрации ингредиентов в опытной среде Микроорганизмы Разведения Варианты опытной среды 1 2 3 А. hydrophila 10^-6 + + + 10^-7 - + + 10^-8 - + + 10^-9 - - - А. veronii 10^-6 + + + 10^-7 + + + 10^-8 - + + 10^-9 - - + А. salmonicida 10^-6 + + + 10^-7 + + + 10^-8 - + + 10^-9 - - - А. caviae 10^-6 + + + 10^-7 - + + 10^-8 - + + 10^-9 - - -

Рост бактерий рода Aeromonas в количестве, соответствующем посевной дозе микроорганизма, отмечен на среде с минимальным и оптимальным содержанием питательной основы (пептон ферментативный, экстракт кормовых дрожжей, L-аргинин). Преимущественный рост аэромонад регистрировали при оптимальном содержании питательной основы. При этом видимый эффект изменения цвета среды c исходного зеленого на голубой проявлялся при повышении содержания L-аргинина с 2,0 г до 3,5 г. При использовании в среде одного индикатора бромтимоловый синий изменение цвета среды (вариант среды 2) на голубой при культивировании аэромонад не достигается. В процессе роста синегнойные палочки не изменяют исходный зеленый цвет среды. Рост других микроорганизмов (E. coli, S. paratyphi B, S. aureus, E. faecalis) зависит от посевной дозы микроорганизма и на среде с дезоксихолатом натрия и ампициллином наблюдали отсутствие или значительное угнетение роста. Увеличение количества до 3 г дезоксихолата натрия не влияет на рост энтерококков и золотистого стафилококка, по сравнению с указанными параметрами. При этом снижение количества ингибирующего вещества удешевляет стоимость среды. Питательная среда обладает хорошими ростовыми и накопительными свойствами, эффективность накопления на порядок выше чем в ГРМ-бульоне (таблица 5).

Taблица 5 Сравнение чувствительности питательных сред накопления для выделения аэромонад из водных объектов Тест-штаммы Опытная среда ГРМ-бульон Разведение Разведение 10^-7 10^-8 10^-9 10^-7 10^-8 10^-9 А. hydrophila + + - + - - A. veronii + + + + + - A. salmonicida + + - + - - A. caviae + + - + - -

Способ приготовления питательной среды для выделения аэромонад заключается в следующем: в химически чистую стеклянную термостойкую колбу, например, двухлитровую круглую плоскодонную или коническую колбу по ГОСТ 25336-82 добавляют навески в г/л: ферментативного пептона - 10,0; хлористого натрия - 9,0; экстракт кормовых дрожжей - 3,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0 г (в соответствии с ГОСТ 4198-73 ЧДА); магния сульфат - 0,2 г и вносят дистиллированную воду до 1 литра с последующим перемешиванием до полного растворения. Затем полученную смесь нагревают с последующим перемешиванием до их полного растворения. После чего добавляют навески в г/л: L-аргинин солянокислый (в соответствии с ТУ 6-09-2100-78) - 3,5 г, спиртовой раствор бромтимолового синего водорастворимый (в соответствии с ТУ 6-09-07-1602-87) - 0,03 г (в виде 1,6 % спиртового раствора - 1,88 мл), тимоловый синий (в соответствии с ТУ 6-09-3501-78) - 0,03 г и гидроксид натрия (в соответствии с ГОСТ4328-77 ЧДА) - 0,35±0,05 г (в соответствии с ГОСТ 4328-77 ХЧ). Далее устанавливают рН 8,3±0,2 при помощи 20% водного раствора гидроокиси натрия. После чего стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм. (121°С) в течение 10 мин. Затем в охлажденную среду вносят дезоксихолата натрия 2,0 г и ампициллина 0,005 г. Разливают в стерильные флаконы и пробирки и культивируют при температуре 28 ± 2°С в течение 18-24 часов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную селективную среду для выделения аэромонад из водных объектов, которая содержит пептон, экстракт кормовых дрожжей, аргинин, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, хлорид натрия, дезоксихолат, гидроксид натрия, бромтимоловый синий, тимоловый синий, ампициллин и воду дистиллированную. Изобретение позволяет повысить накопительные и селективные свойства для выделения аэромонад из водных объектов. 5 табл.

Питательная селективная среда для выделения аэромонад из водных объектов, содержащая пептон, экстракт кормовых дрожжей, аргинин, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, хлорид натрия, дезоксихолат, гидроксид натрия, бромтимоловый синий, тимоловый синий, ампициллин и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пептон ферментативный 10 Экстракт кормовых дрожжей 3 L-аргинин солянокислый 3,5 Натрий хлорид 9 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Магния сульфат 0,2 Дезоксихолат натрия 2 Гидроксид натрия 0,35±0,05 Бромтимоловый синий 0,03 Тимоловый синий 0,03 Ампициллин 0,005 Дистиллированная вода до 1000 мл