УЛУЧШЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СОИ Российский патент 2010 года по МПК C12N15/82 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Agrobacterium-опосредствованная трансформация с использованием меристематических клеток первичных или верхних листовых узлов в качестве целевой ткани и последующей регенерации целого растения из трансформированных клеток обеспечивает улучшенное встраивание ДНК в геном растения сои (Glycine max). 12 з.п. ф-лы, 40 ил., 11 табл.

1. Способ получения трансгенного растения сои, который включает следующие стадии:
а) получение пазушной меристематической ткани первичного или высшего листового узла сеянца сои, и
(b) совместное культивирование указанной пазушной меристематической ткани с бактерией Agrobacterium, содержащей трансгенную Т-ДНК, содержащую как минимум одну растительную экспрессионную кассету для агрономически ценного признака, и, необязательно, один или более выбираемых маркерных генов, и
(c) перенос указанной совместно культивированной пазушной меристематической ткани в среду, индуцирующую побегообразование, содержащую
(i) по крайней мере, один растительный фактор роста в концентрации, пригодной для индуцирования образования новых побегов из указанной пазушной меристематической ткани, и
(ii) необязательно, одно или более селекционных веществ, которые в сочетании с выбираемым маркерным геном (b) позволяют идентифицировать и/или селектировать растительную клетку, ткань или растение, содержащее указанный выбираемый маркерный ген, и/или
(iii) необязательно, один или более антибиотиков, пригодных для ингибирования роста Agrobacterium, и
культивирование указанной совместно культивированной пазушной меристематической ткани до индуцирования и развития из нее побегов и выделение указанных побегов,
(d) перенос указанных выделенных побегов на среду для укоренения и культивирование указанных побегов до образования корней у этих побегов и дальнейшей регенерации полученных таким образом проростков в зрелые растения, которые имеют вставленную в их геном Т-ДНК, содержащую указанную, по крайней мере, одну растительную экспрессионную кассету для агрономически ценного признака, и необязательно, по крайней мере, один указанный выбираемый маркерный ген.

2. Способ по п.1, который дополнительно включает один или более стадий, выбранных из следующей группы:
(а1) скарификация эксплантата перед, во время или непосредственно после совместного культивирования, и
(b1) перенос указанной совместно культивированной пазушной меристематической ткани после стадии (b) на среду, содержащую, по крайней мере, один антибиотик, пригодный для ингибирования роста Agrobacterium и, необязательно, по крайней мере, один растительный фактор роста, при этом указанная среда предпочтительно не содержит селекционных веществ, которые в сочетании с выбираемым маркерным геном (b) позволяют идентифицировать и/или селектировать растительные клетки, органы или ткани, содержащие указанный выбираемый маркерный ген, и
(b2) дальнейшее инкубирование указанной пазушной меристематической ткани после стадии (b) и, необязательно (b1), на среде, индуцирующей побеги (SIM) и содержащей, по крайней мере, один растительный фактор роста, при этом указанная среда, индуцирующая побеги, предпочтительно не содержит селекционных веществ, которые в сочетании с выбираемым маркерным геном (b) позволяют идентифицировать и/или селектировать растительные клетки, органы или ткани, содержащие указанный выбираемый маркерный ген и,
(с1) перенос указанных побегов после стадии (с) на среду, индуцирующую удлинение побегов, содержащую
(i) по крайней мере, один растительный фактор роста в концентрации, пригодной для удлинения побегов, и
(ii) необязательно, одно или более селекционных веществ, которые в сочетании с выбираемым маркерным геном (b) позволяют идентифицировать и/или селектировать растительную клетку, ткань или растение, содержащие указанный выбираемый маркерный ген, и культивирование указанных перенесенных побегов на указанную среду для удлинения побегов до тех пор, пока они не будут иметь длину, составляющую, по крайней мере, 2 см.

3. Способ по п.1 или 2, в котором пазушная меристематическая ткань первичного или высшего узла представлена в форме, выбранной из следующей группы:
a) сеянцевая пазушная меристема, представленная в основном целым сеянцем, и
b) листовая пазушная меристема, полученная отсечением первичных или высших листьев таким образом, чтобы ткань пазушной меристемы оставалась присоединенной к черешку листьев, и
c) размноженная пазушная меристема.

4. Способ по п.3, в котором в основном целый сеянец выбран из группы материалов, состоящей из
a) целого сеянца и
b) сеянца с удаленным корнем, и
c) сеянца с удаленной одной или обеими семядолями, и
d) сеянца с удаленным корнем и одной или обеими семядолями, и
e) сеянца с удаленным корнем и обеими семядолями и частью эпикотиля и оставленной пазушной меристемой, присоединенной к части эпикотиля.

5. Способ по п.1 или 2, в котором сеянцы сои прорастают от приблизительно 4 до 10 дней перед получением эксплантатов.

6. Способ по п.1 или 2, в котором среда, по крайней мере, одной стадии (b), (b1), (b2) и/или (с) содержит цитокинин.

7. Способ по п.6, в котором цитокинин является 6-бензиламинопурином в концентрации в пределах от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ.

8. Способ по п.1 или 2, где среда, по крайней мере, на одной из стадий (b), (b1), (b2), (с) и/или (с1), предпочтительно, по крайней мере, (b) и (с1), содержит от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 2 мкМ гибберелловой кислоты (GA3).

9. Способ по п.1 или 2, в котором среда, по крайней мере, одной стадии (b), (b1), (b2), и/или (с), содержит, по крайней мере, одно тиоловое соединение.

10. Способ по п.9, в котором тиоловое соединение является L-цистеином в концентрации в пределах от приблизительно 1 мкМ до 10 мкМ, дитиотрейтолом концентрации в пределах от приблизительно 0,1 мкМ до 5 мкМ и/или тиосульфатом натрия в концентрации в пределах от приблизительно 0,1 мкМ до 5 мкМ.

11. Способ по п.1 или 2, в котором среда, по крайней мере, на одной из стадий (с1) и/или (d) содержит от приблизительно 0,01 мг/л до приблизительно 1 мкМ мг/л индолилуксусной кислоты (IAA), и/или от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 4 мкМ гибберелловой кислоты (GA3), и/или от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 6 мкМ рибозеатиновой кислоты.

12. Способ по п.1 или 2, в котором Agrobacterium является штаммом, выбранным из группы, включающей обезвреженные штаммы Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes.

13. Способ по п.12, в котором штаммом Agrobacterium является обезвреженный штамм Agrobacterium rhizogenes K599.