ВЫСУШЕННАЯ РАСПЫЛЕНИЕМ 3-ФУКОЗИЛЛАКТОЗА Российский патент 2023 года по МПК A23L33/00 A23P10/40 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к препаратам олигосахарида женского (человеческого) молока. В частности, настоящее изобретение относится к твердым препаратам олигосахаридов женского молока и к способам получения твердых препаратов олигосахаридов женского молока.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Женское грудное молоко содержит значительное количество углеводов. Эти углеводы включают такие моносахариды, как L-фукоза и N-ацетилнейраминовая кислот (Neu5Ac). В женском грудном молоке также присутствует такой дисахарид, как лактоза. Кроме лактозы один литр женского грудного молока содержит до 20 г/л олигосахаридов, так называемых "олигосахаридов женского (человеческого) молока (англ. human milk oligosaccharides, сокращенно HMO)". HMO представляют собой третью по количеству составляющую женского грудного молока. Предположительно, в женском молоке содержится более 150 структурно различных олигосахаридов. Обычно женское молоко содержит от 10 до 13 основных НМО, которые присутствуют в концентрации, составляющей от нескольких граммов до нескольких сотен миллиграммов на литр (Thurl с соавт., (2017), Nutrition Reviews 75(11) 920-933). НМО включают нейтральные НМО, а также кислотные НМО, которые содержат один или более фрагментов сиаловой кислоты. Наиболее важные НМО представлены в Таблице 1. Сложные структуры и содержание этих олигосахаридов в женском молоке уникальны, и эти олигосахариды не были обнаружены в молоке других млекопитающих, таких как, например, одомашненные молочные животные.

Поскольку НМО не перевариваются человеком, физиологическую роль этих сахаридов изучали в течение нескольких десятилетий. Пребиотический эффект НМО был открыт более 100 лет назад. НМО способны регулировать кишечную флору человека посредством доставки в кишечник полезных бактерий. В последнее время исследовали некоторые другие функции НМО, в частности, их влияние на развитие новорожденных. Известно, что НМО действуют как средства отвлечения, что приводит к снижению риска инфицирования бактериальными и вирусными патогенами, которые прикрепляются к человеческим клеткам, связываясь с гликопротеинами клеточной поверхности. Дополнительно, различные НМО оказывают противовоспалительное действие и действуют как иммуномодуляторы. Таким образом, было предположено, что НМО снижают риск развития пищевых аллергий. Широко обсуждается полезное воздействие сиалилированных НМО на развитие мозга у новорожденных (обзор в публикации: "Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Origins and functions of milk-borne oligosaccharides and bacteria (Пребиотики и пробиотики в женском молоке, происхождение и функции содержащихся в молоке олигосахаридов и бактерий)", Academic Press (2017), редакторы: McGuire М., McGuire М. и Bode L).

Одним из НМО является 3-фукозиллактоза (Gal(β1-4)[Fuc(β1-3)]Glc)). Впервые 3-фукозиллактоза (3-FL) была выделена из молока в 1958 году, и впервые она была выделена из мочи женщины с группой крови О, несекретора, в период беременности и кормления грудью в 1977 году. 3-Фукозиллактоза устойчива к ферментативному гидролизу в желудочно-кишечном тракте младенца. Предполагается, что 3-фукозиллактоза достигает толстого кишечника, где она усваивается и перерабатывается бактериями.

Первым этапом использования полезных свойств НМО в искусственном вскармливании младенцев является добавление отдельных НМО в детскую питательную смесь. Однако лучшим решением было бы добавление в детскую питательную смесь комбинации структурно различных НМО, поскольку комбинация структурно различных НМО будет действовать образом, более схожим с первоначальным источником НМО, т.е. с женским молоком, и этот эффект не может быть достигнут при добавлении одного конкретного НМО.

На начальном этапе ограниченный доступ к отдельным НМО для добавления в детские питательные смеси привел к разработке химических способов синтеза НМО, которые затем были заменены биокаталитическими способами с применением очищенных ферментов. В настоящее время для получения различных НМО в коммерческих масштабах применяют ферментацию генетически модифицированных бактериальных клеток (WO 2015/150328 А1, WO 2017/043382 А1, WO 2010/070104 А1, WO 2012/097950 А1). НМО, синтезированные бактериальными клетками, могут быть очищены от из ферментационного бульона или клеточного лизата в виде по существу чистых препаратов НМО, которые могут быть добавлены в пищу человека, в частности, в питание для младенцев.

Во время очистки 3-фукозиллактозы этот сахарид обычно находится в жидком технологическом потоке. При проведении очистки концентрация 3-фукозиллактозы в технологическом потоке повышается. Однако водный раствор 3-фукозиллактозы очень чувствителен к бактериальному или грибковому загрязнению. Таким образом, 3-фукозиллактозу предпочтительно получать в виде сухого продукта, имеющего низкое содержание воды, делающее невозможным рост микробов.

Обычно твердые сахариды получают кристаллизацией. Была описана кристаллизация следующих отдельно взятых НМО: 3-фукозиллактозы (WO 2014/075680 А), 2'-фукозиллактозы (WO 2011/150939 А), ди-фукозиллактозы (WO 2016/086947 А), лакто-N-тетраозы (WO 2017/101953 А), лакто-N-неотетраозы (WO 2014/094783 А). Кристаллизация НМО включает применение органических растворителей, таких как спирты, в основном этанол или метанол, или органических кислот, таких как ледяная уксусная кислота. Однако, если НМО намереваются использовать в качестве пищевых ингредиентов, то применение органических растворителей для кристаллизации НМО в последнем этапе способа получения готового продукта в твердой форме нежелательно. Кроме того, органические растворители наносят вред окружающей среде и вредят здоровью работающих с ними людей. Таким образом, применение органических растворителей требует определенных мер охраны труда и подходящей утилизации, что делает применение органических растворителей дорогостоящим. Таким образом, кристаллизацию НМО с целью получения НМО в твердой форме можно рассматривать как недостаток способа получения НМО в промышленном масштабе.

Таким образом, имеется необходимость создания способа получения НМО, в частности, 3-фукозиллактозы, в твердой форме, где способ может быть применен в промышленном масштабе для получения НМО и не включает применения органического растворителя для завершения очистки с целью получения твердого препарата НМО.

Поставленная задача может быть решена посредством применения способа получения порошка, по существу состоящего из очищенного НМО, где способ включает распылительную сушку водного раствора, который содержит НМО.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения относится к способу получения высушенного распылением (т.е. высушенного распылительной сушкой) порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы.

Второй аспект относится к способу получения высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы.

Третий аспект относится к применению высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы, для получения питательной композиции.

Четвертый аспект относится к питательной композиции, содержащей высушенный распылением порошок, по существу состоящий из 3-фукозиллактозы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 3-фукозиллактозы.

На Фиг. 2 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением лакто-N-тетраозы.

На Фиг. 3 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 6'-сиалиллактозы.

На Фиг. 4 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 3'-сиалиллактозы.

На Фиг. 5 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением смеси 2'-фукозиллактозы и лакто-N-тетраозы.

На Фиг. 6 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением смеси 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения относится к высушенному распылением порошку, по существу состоящему из 3-фукозиллактозы, получаемой способом микробной ферментации.

3-Фукозиллактозу получают способом микробной ферментации, рассмотренным ниже в настоящей работе. Употребляемый в настоящей работе термин "по существу состоящий из" означает, что высушенный распылением порошок состоит из 3-фукозиллактозы и необязательно побочных продуктов, образующихся в результате микробной ферментации при получении 3-фукозиллактозы, которые не могут быть удалены из технологического потока, получаемого при микробной ферментации. Термин "по существу состоящий из" включает высушенные распылением порошки, состоящие из по меньшей мере 80% масс, по меньшей мере 85% масс, по меньшей мере 90% масс, по меньшей мере 93% масс, по меньшей мере 95% масс, или по меньшей мере 98% масс.3-фукозиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления 3-фукозиллактоза находится в высушенном распылением порошке в аморфной форме.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления высушенный распылением порошок содержит ≤15% масс. воды, предпочтительно ≤10% масс. воды, более предпочтительно ≤7% масс. воды, наиболее предпочтительно ≤5% масс. воды.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления высушенный распылением порошок не содержит генетически модифицированных микроорганизмов и молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов.

Второй аспект относится к способу получения высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы, который получен способом микробной ферментации. Способ включает следующие этапы:

a) очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона;

b) предоставление водного раствора 3-фукозиллактозы стадии а), и

c) подвергание раствора стадии b) распылительной сушке.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона включает одну или более из следующих стадий:

i) удаление микробных клеток из ферментационного бульона с получением осветленного технологического потока;

ii) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной ультрафильтрации;

iii) по меньшей мере однократная обработка осветленного технологического потока катионообменной смолой и/или по меньшей мере однократная обработка анионообменной смолой;

iv) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной нанофильтрации;

v) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одному электродиализу;

vi) по меньшей мере однократная обработка осветленного технологического потока активированным углем; и/или

vii) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной кристаллизации и/или осаждению.

3-Фукозиллактоза может быть получена способом микробной ферментации, в котором генетически модифицированный микроорганизм, способный синтезировать 3-фукозиллактозу, культивируют в культуральной среде (ферментационном бульоне) в условиях, позволяющих генетически модифицированному микроорганизму синтезировать 3-фукозиллактозу. Очистка 3-фукозиллактозы, получаемой способом микробной ферментации, включает стадию отделения микробных клеток от ферментационного бульона, в результате чего получают осветленный технологический поток, который по существу не содержит клеток и который содержит 3-фукозиллактозу. Данная стадия представляет собой первую стадию способа очистки целевых олигосахаридов.

Подходящие способы отделения микробных клеток от ферментационного бульона включают центрифугирование, где микробные клетки получают в виде гранул, а ферментационный бульон - в виде супернатанта. В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления микробные клетки отделяют от ферментационного бульона с помощью фильтрации. Подходящие способы фильтрации для отделения клеток от ферментационного бульона включают микрофильтрацию и ультрафильтрацию.

Микрофильтрация как таковая представляет собой способ физического фильтрования, в котором жидкость, содержащую частицы, пропускают через мембрану с определенным размером пор для отделения частиц от жидкости. Употребляемый в настоящей работе термин "микрофильтрация" относится к способу физического фильтрования, в котором клетки отделяют от ферментационного бульона.

Ультрафильтрация представляет собой вариант фильтрования через мембрану и кардинально от него не отличается. При проведении ультрафильтрации такие силы, как давление или градиенты концентрации становятся причиной разделения на полупроницаемой мембране. Клетки, суспендированные твердые вещества и высокомолекулярные растворенные вещества удерживаются в так называемом ретентате, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества, такие как целевые сиалилированные олигосахариды, проходят через мембрану, попадая в пермеат (фильтрат).

Ультрафильтрационные мембраны характеризуются величиной номинального отсечения по молекулярной массе (англ. molecular weight cut-off, сокращенно MWCO) применяемой мембраны. Ультрафильтрацию выполняют в режиме перекрестного потока или в тупиковом режиме.

Обычно микробные клетки синтезируют 3-фукозиллактозу внутриклеточно и секретирут ее в ферментационный бульон. Полученная таким образом 3-фукозиллактоза оказывается в ферментационном бульоне, который затем подвергают дальнейшей обработке, рассмотренной в настоящей работе ниже, с целью очистки 3-фукозиллактозы.

Независимо от того, какой способ применяют для очистки 3-фукозиллактозы, полученной способом микробной ферментации, этот способ также может быть применен для очистки 3-фукозиллактозы, полученной ферментативным катализом in vitro. 3-Фукозиллактоза может быть очищена от реакционной смеси по окончании биокаталитической реакции. Реакционную смесь подвергают очистке в виде осветленного технологического потока.

Осветленный технологический поток содержит 3-фукозиллактозу, а также побочные продукты и нежелательные примеси, такие как, например, моносахариды, дисахариды, нежелательные побочные продукты олигосахаридов, ионы, аминокислоты, полипептиды, белки и/или нуклеиновые кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает этап по меньшей мере одной катионообменной обработки для удаления положительно заряженных соединений из осветленного технологического потока.

Подходящие катионообменные смолы для удаления положительно заряженных соединений включают Lewatit S2568 (Н+) (Lanxess AG, Cologne, DE).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию анионообменной обработки для удаления нежелательных отрицательно заряженных соединений из осветленного технологического потока.

Подходящие анионообменные смолы включают Lewatit S6368 A, Lewatit S4268, Lewatit S5528, Lewatit S6368A (Lanxess AG. Cologne, DE), Dowex AG 1×2 (Mesh 200-400), Dowex 1×8 (Mesh 100-200), Purolite Chromalite CGA100×4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), DowAmberlite FPA51 (Dow Chemicals, Ml, USA).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию нанофильтрации и/или диафильтрации для удаления примесей с более низкой молекулярной массой и для концентрирования целевых олигосахаридов.

Диафильтрация включает добавление к раствору свежей (пресной, англ. fresh) воды для удаления (вымывания) проходящих через мембрану компонентов. Диафильтрация может быть применена для разделения компонентов в соответствии с размерами и зарядом их молекул с помощью подходящих мембран; при диафильтрации один или более видов частиц эффективно задерживается мембраной, и другой вид частиц проходит через мембрану. В частности, диафильтрация с применением нанофильтрационной мембраны подходит для разделения низкомолекулярных соединений, таких как небольшие молекулы и соли. Нанофильтрационные мембраны обычно имеют номинальное отсечение по молекулярной массе, составляющее от 150 до 1000 Дальтон. Нанофильтрацию широко применяют в молочной промышленности для концентрирования и деминерализации молочной сыворотки.

Подходящие для нанофильтрации и/или диафильтрации мембраны включают Dow Filmtec NF270-4040, Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 и GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).

Было обнаружено, что диафильтрация с помощью нанофильтрационных мембран является эффективной предварительной обработкой с целью удаления значительных количеств загрязняющих веществ перед обработкой электродиализом раствора, содержащего олигосахарид. Применение нанофильтрационных мембран для концентрирования и диафильтрации в целях очистки НМО приводит снижению расхода энергии и технологических затрат, а также к повышению качества продукта из-за снижения термических воздействий, что приводит к снижению вероятности протекания реакции Майяра и альдольной конденсации.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает по меньшей мере одну стадию электродиализа.

Электродиализ (ЭД) является комбинацией диализа и электролиза и может быть применен для разделения или концентрация ионов в растворах на основании их селективной миграции через полупроницаемые мембраны под действием электрического тока.

В принципе, устройство для электродиализа состоит из электролитической ячейки, включающей пару электродов, погруженных в электролит для транспортировки ионов, соединенных с генератором постоянного тока. Электрод, соединенный с положительным полюсом генератора постоянного тока, называется анодом, а электрод, соединенный с отрицательным полюсом, называется катодом. Электрический ток протекает через раствор электролита, что приводит к перемещению отрицательно и положительно заряженных ионов по направлению к аноду и катоду соответственно. Применяемые для электродиализа мембраны по существу представляют собой листы пористой ионообменной смолы, содержащие отрицательно или положительно заряженные группы, и, таким образом, их соответственно называют катионными или анионными мембранами. Ионообменные мембраны обычно изготавливают из включающего подходящую функциональную группу (такую как сульфоновая кислота в катионных мембранах или четвертичную аммонийную группу в анионных мембранах) полистирола, образующего поперечные связи с дивинилбензолом. Электролит может представлять собой, например, хлорид натрия, ацетат натрия, пропионат натрия или сульфаминовую кислоту. Установку для электродиализа собирают таким образом, чтобы анионные и катионные мембраны располагались параллельно, как в фильтр-прессе, между двумя электродными блоками, в результате чего поток, из которого извлекаются ионы, успешно отделяется от потока, который обогащается ионами (эти два раствора также называются разбавленными раствором (обедняемым ионами) и концентратом (обогащаемым ионами)). Основной частью способа электродиализа является установленный между двумя электродами мембранный пакет, который состоит из нескольких анионообменных мембран и катионообменных мембран, разделенных разделителями. При подаче постоянного электрического тока анионы и катионы начинают мигрировать через мембраны по направлению к электродам.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы дополнительно включает стадию непрерывной хроматографии, такой как хроматография с псевдодвижущимся слоем (ПДС-хроматография).

Хроматография с псевдодвижущимся слоем (ПДС) была изобретена в нефтехимической и горнодобывающей отрасли. В настоящее время ПДС-хроматографию применяют в фармацевтической промышленности для выделения энантиомеров из рацемических смесей. Крупномасштабная ПДС-хроматография уже применялась для выделения моносахарида фруктозы из растворов, содержащих фруктозу и глюкозу, и для выделения дисахарида сахарозы из сиропов, содержащих свекловичный сахар или тростниковый сахар.

В способах с ПДС, применяемых для разделения сахаридов, применяют, например, содержащие кальций, сшитые поперечными связями полистирольные смолы, анионные смолы в бисульфитной форме (Bechthold М., с соавт., Chemie Ingenieur Technik, 2010, 82, 65-75) или сильнокислую катионную смолу на основе полистирольного геля в водородной форме (Purolite PCR833H) (Purolite, Bala Cynwyd, USA).

При непрерывном режиме работы, рециркуляции подвижной фазы, а также при возможности применения колонок больших размеров, системы с ПДС, в принципе, могут быть увеличены до достижения объемов продукции, составляющих сотни тонн.

Преимущество этапа способа, представляющего собой хроматографию с псевдодвижущимся слоем, состоит в том, что этот этап способа позволяет дополнительно удалять олигосахариды, структурно близкие к целевому олигосахариду.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает обработку технологического потока активированным углем для удаления из технологического потока загрязняющих веществ, таких как красители.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает по меньшей мере один этап кристаллизации или осаждения 3-фукозиллактозы из осветленного технологического потока. Кристаллизацию или осаждение 3-фукозиллактозы из технологического потока можно осуществить добавлением подходящего количества органического растворителя, способного смешиваться с водой технологического потока, содержащего 3-фукозиллактозу. Органический растворитель может быть выбран из группы, состоящей из С₁-С₆-спиртов и С₁-С₄-карбоновых кислот.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию стерильного фильтрования и/или удаления эндотоксина, предпочтительно фильтрованием технологического потока через фильтр с отсечением по молекулярной массе 3 кДа или фильтр с отсечением по молекулярной массе 6 кДа.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию повышения концентрации 3-фукозиллактозы в технологическом потоке. Концентрация 3-фукозиллактозы в технологическом потоке может быть повышена посредством испарения технологического потока в вакууме, обратного осмоса технологического потока или нанофильтрации технологического потока (например, нанофильтрации через нанофильтрационную мембрану с отсечением по размеру ≤20 ). В альтернативном варианте кристаллизованную или осажденную 3-фукозиллактозу растворяют в воде, получая раствор 3-фукозиллактозы, имеющий целевую концентрацию 3-фукозиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления полученный технологический поток представляет собой водный раствор, который содержит 3-фукозиллактозу в концентрации, составляющей ≥20 г/л, ≥25 г/л, ≥30 г/л, ≥40 г/л, ≥60 г/л, ≥100 г/л, ≥200 г/л или даже ≥300 г/л.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор содержит 3-фукозиллактозу с чистотой, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% в пересчете на массу сухого вещества/растворенных веществ, находящихся в растворе.

Полученный концентрат, содержащий очищенную 3-фукозиллактозу, может храниться в подходящих условиях.

Способ очистки 3-фукозиллактозы экономичен и легко поддается адаптации для больших масштабов, что делает его подходящим в качестве основы для многотоннажного производства.

Другим преимуществом способа очистки 3-фукозиллактозы является то, что водный раствор не содержит генетически модифицированных микроорганизмов и молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов. Кроме того, водный раствор не содержит белков. Полное удаление белков устраняет риск развития аллергий у потенциального потребителя.

Способ получения высушенного распылением порошка включает стадию предоставления водного раствора, содержащего 3-фукозиллактозу.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор содержит 3-фукозиллактозу в количестве, составляющем по меньшей мере 20% (масс./об.), 30% (масс./об.), 35% (масс./об.) и до 45% (масс./об.), 50% (масс./об.), 60% (масс./об.).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор содержит 3-фукозиллактозу с чистотой, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% в пересчете на массу сухого вещества/растворенных веществ, находящихся в растворе.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор не содержит генетически модифицированных микроорганизмов, молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов, и белков.

В способе получения высушенного распылением порошка водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, подвергают распылительной сушке.

Распылительная сушка представляет собой способ получения сухих порошков, в котором раствор, содержащий интересующее вещество (т.е. 3-фукозиллактозу), сначала распыляют на капли, которые быстро высушиваются горячим воздухом. Распылительная сушка протекает очень быстро, и воздействие на высушиваемое вещество высоких температур весьма кратковременно.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, который был очищен от ферментационного бульона или выделен из технологического потока, сушат распылением при температуре сопла, составляющей по меньшей мере 110°С, предпочтительно по меньшей мере 120°С, более предпочтительно по меньшей мере 125°С, и менее 150°С, предпочтительно менее 140°С и более предпочтительно менее 135°С.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, который был очищен от ферментационного бульона или выделен из технологического потока, сушат распылением при выходной температуре, составляющей по меньшей мере 60°С, предпочтительно по меньшей мере 65°С, и менее 80°С, предпочтительно менее 70°С. В особенно предпочтительном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, сушат распылением при температуре сопла, составляющей от приблизительно 68°С до приблизительно 70°С.

Распылительная сушка водного раствора, содержащего 3-фукозиллактозу, позволяет получать порошок, имеющий низкую гигроскопичность, в котором 3-фукозиллактоза находится в аморфной форме и имеет одинаковый размер частиц.

Третий аспект относится к применению высушенного распылением порошка, содержащего 3-фукозиллактозу, который был выделен из технологического потока, для приготовления питательной композиции. Высушенный распылением порошок, по существу состоящий из 3-фукозиллактозы, подходит для потребления человеком и, таким образом, может быть включен в препараты для потребления человеком, такие как медицинские композиции, детские питательные смеси, молочные напитки или пищевые добавки.

Четвертый аспект относится к питательным композициям, которые содержат высушенный распылением порошок, раскрытый в первом аспекте и получаемый согласно второму аспекту.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный НМО, который не является 3-фукозиллактозой. По меньшей мере один дополнительный НМО может представлять собой нейтральный НМО, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), лакто-N-тетраозы (LNT), лакто-N-неотетраозы (LNnT) и лакто-N-фукопентаозы I (LNFPI). В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления по меньшей мере один дополнительный НМО может представлять собой сиалилированный НМО, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы (3'-SL), 6'-сиалиллактозы (6'-SL), сиалиллакто-N-тетраозы (LST)-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраозы (DSLNT).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция включает смесь, по существу состоящую из Neu5Ac, 2'-FL, 3-FL, L/VT, L/VnT, L/VFPI, 3'-SL, 6'-SL, сиаловой кислоты и L-фукозы. Питательная композиция, включающая предпочтительные количества каждого из указанных соединений, представлена в Таблице 1.

Композиция, состав которой приведен во второй колонке Таблицы 1, особенно предпочтительна для добавления в детскую питательную смесь, чтобы готовая детская питательная смесь для непосредственного потребления могла содержать соединения в концентрациях, указанных в третьей колонке Таблицы 1.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция содержит один или более дополнительных ингредиентов. Один или более дополнительных ингредиентов выбраны из группы, состоящей из масла, жира и жирных кислот (таких как оливковое масло, подсолнечное масло, кокосовое масло, ореховое масло, рапсовое масло, пальмовое масло, льняное масло, рыбий жир, линоленовая кислота, соевое масло и т.д.), углеводов (таких как глюкоза, фруктоза, лактоза, мальтодекстрин, крахмал, сахароза, инозит и т.д.), белков (снятого молока, молочной сыворотки, казеина (полученных от любого из одомашненных молочных животных) или сои), витаминов (А, В1, В2, В5, В6, В12, С, D, Е, K, биотина, фолиевой кислоты, ниацина, холина) минералов и редких элементов (натрия, калия, хлорида, кальция, фосфора, магния, железа, цинка, марганца, фторида, селена, йода, меди).

В одном из предпочтительных примеров осуществления питательная композиция, содержащая высушенные распылением олигосахариды женского молока или смесь олигосахаридов женского молока или смесь олигосахаридов женского молока с функциональными моносахаридами или смесь олигосахаридов женского молока с другими волокнами, представляет собой детскую питательную смесь, которая соответствует требованиям к составу, установленным Регламентом (ЕС) 2016/127 и/или Сводом федеральных постановлений США (Code of Federal Regulations, USA), Заголовок 21 107.100 (характеристики питательных веществ). Репрезентативные композиции детских питательных смесей представлены в Таблицах 2 и 3.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция также содержит микроорганизмы, предпочтительно пробиотические микроорганизмы. Для получения пищевых продуктов для младенцев предпочтительные микроорганизмы получены из или могут находиться в кишечной флоре здорового человека. Предпочтительно, без ограничений, микроорганизмы выбраны из следующих видов: Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium и Saccharomyces. В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления микроорганизм выбран из группы, состоящей из Bifidobacterium adolescentis, В. animalis, В. bifidum, В. breve, В. infantis, В. lactis, В. longum; Enterococcus faecium; Escherichia coli; Klyveromyces marxianus; Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius, L. sakei; Lactococcus lactis (включая, без ограничений, подвиды lactis, cremoris и diacetylactis); Leuconostoc mesenteroides (включая, без ограничений, подвид mesenteroides); Pedicoccus acidilactici, P. pentosaceus; Propionibacterium acidipropionici, P. freudenreichii ssp.shermanii; Staphylococcus carnosus; и Streptococcus thermophilus.

Кроме комбинации живых организмов, питательная композиция также может включать культуры мертвых клеток. В области техники пробиотических веществ иногда применяют культуры убитых клеток (например, тиндализованных бактерий). Убитые культуры могут служить источником белков, пептидов, олигосахаридов, фрагментов наружной стенки клеток и натуральных продуктов, которые вызывают кратковременную стимуляцию иммунной системы.

Включение пробиотических микроорганизмов в питательную композицию, в частности, в присутствии НМО, особенно предпочтительно тем, что это также способствует установлению здоровой флоры кишечника.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция также включает пребиотические вещества, такие как галакто-олигосахариды (ГОС), фрукто-олигосахариды (ФОС), инулин или их комбинации.

Питательная композиция находится в твердой форме, примеры которой включают, без ограничений, порошки, гранулы, хлопья, неоднородные гранулы или их комбинации.

В одном из дополнительных примеров осуществления питательная композиция выбрана из группы, состоящей из медицинских композиций, детских питательных смесей, молочных напитков и пищевых добавок.

В качестве медицинской композиции питательная композиция может быть применена для улучшения когнитивной деятельности, в частности, для повышения внимания и для улучшения обучения и/или памяти.

Далее настоящее изобретение дополнительно раскрыто с помощью конкретных примеров осуществления, сопровождаемых графическими материалами, однако, изобретение не ограничено рассмотренными примерами; напротив, изобретение ограничено лишь объемом пунктов формулы изобретения. Кроме того, термины "первый", "второй" и подобные термины, упоминаемые в описании и пунктах формулы изобретения, употребляются для распознавания схожих элементов и необязательны для описания последовательности, как временной, так и пространственной, для описания главенства или любого другого свойства. Следует понимать, что применяемые таким образом термины в подходящих обстоятельствах взаимозаменяемы и что примеры осуществления изобретения, рассмотренные в настоящей работе, могут функционировать в последовательности, отличной от описанной или показанной в настоящей работе.

Следует отметить, что употребляемый в формуле изобретения термин "включающий" не должен рассматриваться как ограниченный перечисленными после него объектами; напротив, он не исключает наличия других элементов или этапов. Таким образом, он указывает на наличие перечисленных после его особенностей, целых чисел, этапов или компонентов, но не исключает наличия или добавления одного или более других особенностей, целых чисел, этапов или компонентов или их групп. Таким образом, объем определения "устройство, включающее средства А и В" не ограничен устройствами, состоящими из только из компонентов А и В. Согласно настоящему изобретению это означает, что единственными относящимися к изобретению компонентами устройства являются А и В.

Упоминание в настоящей работе "одного примера осуществления" или "примера осуществления" означает, что конкретный признак, структура или характеристика, рассмотренная при раскрытии примера осуществления, включена в по меньшей мере один пример осуществления настоящего изобретения. Таким образом, упоминаемые в различных частях настоящей работы фразы "в одном из примеров осуществления" или "в примере осуществления" не обязательно относятся к одному и тому же примеру осуществления. Кроме того, специалисту в данной области техники после прочтения настоящего описания должно быть понятно, что конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть скомбинированы любым подходящим образом с получением одного или более примеров осуществления.

Аналогично, следует понимать, что при описании репрезентативных примеров осуществления изобретения различные признаки изобретения в некоторых случаях сгруппированы вместе в один пример осуществления, фигуру или их описание для упрощения понимания сущности изобретения и облегчения понимания одного или более различных аспектов изобретения. Однако такой способ раскрытия изобретения не должен рассматриваться как то, что заявляемое изобретение требует больше признаков, чем те признаки, которые ясно указаны в каждом пункте формулы изобретения. Напротив, как следует из приведенных пунктов формулы изобретения, аспекты изобретения определяются не всеми перечисленными признаками каждого из описанных выше примеров осуществления. Таким образом, пункты формулы изобретения, приведенные после подробного рассмотрения изобретения, полностью включены в подробное рассмотрение изобретения, и каждый пункт формулы изобретения должен рассматриваться как отдельный пример осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, как должно быть понятно специалистам в данной области техники, в то время как некоторые примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, включают одни, но не другие признаки, включенные в другие примеры осуществления, в объем изобретения включены комбинации признаков различных примеров осуществления, и они образуют другие примеры осуществления. Например, любой из заявленных в приведенных ниже пунктах формулы изобретения примеров осуществления может быть воплощен в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из примеров осуществления рассмотрены в настоящей работе в виде способа или комбинации элементов способа, которые могут быть выполнены процессором компьютерной системы или другими средствами осуществления функций. Таким образом, процессор с инструкциями, необходимыми для выполнения способа или элемента способа, представляет собой средства осуществления способа или элемента способа. Так, рассмотренный в настоящей работе элемент примера осуществления установки является примером средств осуществления функции, выполняемой элементом для воплощения изобретения.

В описании и графических материалах, представленных в настоящей работе, показаны различные конкретные детали. Однако следует понимать, что примеры осуществления изобретения могут быть воплощены без использования этих конкретных деталей. В других примерах для облегчения понимания описания и графических материалов хорошо известные способы, структуры и методики подробно не рассмотрены.

Ниже изобретение раскрыто посредством подробного рассмотрения нескольких примеров осуществления изобретения. Специалисты в данной области техники, на основании имеющихся у них знаний, могут создать другие примеры осуществления изобретения, не выходящие за пределы объема или технической сущности изобретения, которое ограничено лишь объемом прилагаемых пунктов формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Очистка 2'-фукозиллактозы от ферментационного бульона

Получение 2'-фукозиллактозы ферментацией с применением генетически модифицированного штамма Е. coli выполняли как описано в Европейской патентной заявке No. 16196486.1. 2'-Фукозиллактозу выделяли из ферментационного бульона фильтрованием, ионообменной хроматографией, нанофильтрацией, диафильтрацией или электродиализом и обработкой углем как описано в патентной заявке WO 2015/106943 А1. Полученный раствор, содержащий 2'-фукозиллактозу, подвергали распылительной сушке, получая стабильный твердый продукт.

Пример 2

Очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона

3-Фукозиллактозу получали ферментацией с применением генетически модифицированного штамма Е. coli как описано в Европейской патентной заявке No. 16196486.1.

Клетки отделяли от культуральной среды ультрафильтрацией (отсечение по размеру 0,05 мкм) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany) после чего подвергали фильтрации в тангенциальном потоке с MWCO, составляющим 150 кДа (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany). Не содержащую клеток ферментативную среду, содержащую приблизительно 30 г/л 3-фукозиллактозы, пропускали через сильную катионообменную смолу (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany)), находящуюся в Н⁺-форме, для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ. Затем раствор доводили до рН 7,0 добавлением гидроксида натрия и наносили на анионообменную смолу (Lewatit S6368 A, Lanxess), находящуюся в хлоридной форме. В обоих случаях применяли ионообменные устройства объемом 200 л. После второго фильтрования (150 кДа; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) раствор, не содержащий частиц, концентрировали в 5 раз нанофильтрацией с помощью мембраны Filmtech NF270 (Dow, Midland, USA) и в 2,5 испарением в вакууме. Концентрированный раствор с проводимостью приблизительно 15 мС см фильтровали (10 кДа; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany), осветляли активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) и подвергали деионизации электродиализом. Для этого применяли устройство для электродиализа PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Germany), снабженное мембранным пакетом PC-Cell Е200, содержащим следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ:РС SK и анионообменную мембрану AEM:PCAcid60. В качестве электролита в способе применяли 0,25 М сульфаминовую кислоту. Для осветления коричневатого окрашивания, создаваемого продуктами реакции Майяра и альдольной конденсации, получаемыми из продуктов ферментации, проводили повторную ионообменную хроматографию на том же ионообменном материале в вышеуказанных Na⁺ и Cl^- формах, но в объеме 50 л. После концентрации раствора сахара испарением проводимость снова снижали с 4 мС⋅см^-1 до 0,4 мС⋅см^-1 или менее электродиализом с помощью устройства PC-Cell BED 1-3, указанного выше. Для дополнительного обесцвечивания раствор смешивали с активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany), и после фильтрования получали практически бесцветный раствор.

Пример 3

Очистка лакто-N-тетраозы от ферментационного бульона

Лакто-N-тетраозу получали ферментацией в присутствии генетически модифицированного штамма Е. coli BL21 (DE3) ΔlacZ, в геном которого были встроены гены, необходимые для синтеза лакто-N-тетраозы in vivo, а именно: N-ацетилглюкозамин-гликозилтрансферазы (IgtA от Neisseria meningitidis МС58), β-1,3-галактозилтрансферазы (wbdO от Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside), lacY от E.coli K12, а также UDP-глюкозо-4-эпимеразы galE и UTP-глюкозо-1-фосфатуридил-трансферазы galU от E.coli K12. Кроме того, был сврхэкспрессирован ген galS, кодирующий глюкозамин-6-фосфатсинтазу. Для ферментативного синтеза лакто-N-тетраозы штамм выращивали в определенной среде, содержащей минеральные соли и включающей в качестве источника углерода 2% глюкозы. При необходимости добавляли антивспениватель. Величину рН регулировали добавлением 25% раствора аммиака. Лактозу добавляли поэтапно до достижения концентрации 15 мМ из резервуара лактозы с концентрацией 216 г/л; концентрацию лактозы в культуральной среде поддерживали постоянной способом ферментации с вытеснением (throw-out). Остаточную лактозу и лакто-N-триозу II, накапливаемые в способе в качестве побочных продуктов, подвергали гидролизу под действием второго штамма Е. coli, который добавляли в биологический реактор (ферментатор). Этот штамм экспрессировал функциональную бета-лактамазу, бета-N-ацетилгексозамидидазу (bbhl от Bifidobacterium bifidum JCM1254) и функциональный gal-оперон, подходящие для разложения моносахаридов (ЕР 2845905 А).

Клетки отделяли от ферментационного бульона, и жидкость, содержащую лакто-N-тетраозу, очищали до чистоты 75-80%, определяемой по массовому балансу, в соответствии с процедурой, описанной в Примере 2.

Загрязняющие углеводные побочные продукты, получаемые при неэффективном ферментативном разрушении и переработке, удаляют хроматографией с псевдодвижущимся слоем (ПДС) как указано в публикации WO 2015/049331. В альтернативном варианте лакто-N-тетраозу очищали кристаллизацией из изопропанола. Для кристаллизации раствор, содержащий лакто-N-тетраозу, концентрировали испарением до достижения 20% концентрации и высушивали распылением. В устройстве для распылительной сушки NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Germany) раствор пропускали в токе азота через сопла устройства для распылительной сушки, температура впускных отверстий которых составляла 130°С, причем поток продукта регулировали для поддержания выходной температуры, составляющей от 67°С до 68°С.

В смесь изопропанола и воды добавляли твердое вещество (3:1 (об./об.)) в отношении 1 кг порошка на 12 л изопропанола/воды. Суспензии энергично перемешивали, нерастворимую лакто-N-тетраозу отфильтровывали и сушили при 40°С. Из вещества чистотой 73-89% кристаллизованную лакто-N-тетраозу очищали до приблизительно 95% с выходом 85%. Сахар растворяли в воде до достижения концентрации 25% и последовательно пропускали через фильтр с порогом пропускания 6 кДа (ультрафильтрационный модуль Pall Microza SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany) и стерилизующий фильтр с порогом пропускания 0,2 мкм. Твердое вещество получали распылительной сушкой стерильного вещества в условиях, описанных выше.

Пример 4

Очистка 3'- и 6'-сиалиллактозы от ферментационного бульона

Для получения 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы применяли рекомбинантные штаммы Е. coli BL21 (DE3) ΔlacZ. Штаммы имели общие генетические модификации: хромосомную конститутивную экспрессию глюкозамин-6-фосфатсинтазы GlmS от Е. coli, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы SIM975 от Synechocystis sp., глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы Gna1 от Saccharomyces cerevisiae, фосфоенолпируватсинтазы PpsA от Е. coli, а также N-ацетилнейраминатсинтазы NeuB и синтетазы СМР-сиаловой кислоты NeuA от Campylobacter jejuni. Дополнительно, в геном штамма BL21 были интегрированы гены, кодирующие лактозопермеазу LacY от Е. coli, cscB (сахарозопермеазу), cscK (фруктокиназу), cscA (сахарозогидролазу) и cscR (регулятор транскрипции) от Е. coli W, и функциональный да/-оперон, состоящий из генов galE (UDP-глюкозо-4-эпимеразы), galT (галактозо-1-фосфатуридилилтрансферазы), galK (галактокиназы) и galM (галактозо-1-эпимеразы) от Е. coli K12, которые были конститутивно экспрессированы.

Штамм, синтезирующий 3'-сиалиллактозу, содержит ген альфа-2,3-сиалилтрансферазы от Vibrio sp. JT-FAJ-16, а штамм, продуцирующий 6'-сиалиллактозу, содержит ген альфа-2,6-сиалилтрансфераз plsT6 от Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119.

Штаммы, продуцирующие сиалиллактозу, выращивали в определенной среде, содержащей минеральные соли и включающей в качестве источника углерода 2% сахарозы. Загружаемый раствор сахарозы (500 г/л), подаваемый в этапе загрузки периодического способа, был дополнен 8 мМ MgSO₄, 0,1 мМ CaCl₂, редкими элементами и 5 г/л NH₄Cl.

Для получения сиалиллактозы использовали сырье, содержащее лактозу в концентрации 216 г/л. Величину рН регулировали добавлением раствора аммиака (25% об./об.). Ферментацию партии сырья проводили при 30°С при постоянной аэрации и перемешивании. Для удаления остаточной лактозы по окончании ферментации в реактор ферментации добавляли р-галактозидазу. Полученные моносахариды усваивались продуцирующим штаммом.

Не содержащую клеток жидкость затем подвергали деионизации способом ионообменной хроматографии. Сначала на сильной катионообменной смоле, находящейся в Н+-форме (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany), в объеме 200 л удаляли катионные загрязняющие вещества. Полученный раствор доводили до рН 7,0 добавлением NaOH. На втором этапе из раствора с помощью сильной анионообменной смолы Lewatit S 6368 S (Lanxess, Cologne, Germany), находящейся в хпоридной форме, удаляли анионы и нежелательные окрашивающие вещества. Объем слоя ионообменного устройства составлял 200 л. Во втором этапе фильтрования с помощью фильтра для фильтрования в тангенциальном потоке (отсечение по молекулярной массе 150 кДа) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) удаляли осадки, полученные при подкислении раствора. Для концентрирования сахара раствор подвергали нанофильтрации на устройстве Dow FILMTECH NF270-4040 (Inaqua, Monchengladbach, Germany) или в альтернативном варианте с помощью мембраны Trisep 4040-XN45-TSF (отсечение по молекулярной массе 0,5 кДа) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany). С помощью последней от продукта отделяли моносахарид N-ацетилглюкозамин, получаемый при ферментации и загрязняющий раствор сиалиллактозы. Концентрированный раствор сиалиллактозы затем обрабатывали активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) для удаления окрашивающих веществ, таких как продукты реакции Майяра и альдольной конденсации. Для отделения сиалиллактозы от побочных продуктов, образующихся при ферментации, таких как сиаловая кислота и N-ацетилглюкозамин, раствор фильтровали с помощью мембраны с отсечением по молекулярной массе 1 кДа GE4040F30 (GE water & process technologies, Ratingen, Germany) и затем подвергали диафильтрации до достижения проводимости от 0,6 до 0,8 мС⋅м^-1. Разбавленный раствор концентрировали на роторном испарителе до концентрации приблизительно 300 г/л. В итоговом хроматографическом разделении отделяли другие загрязняющие сахара, такие как дисиалиллактоза. Сконцентрированный таким образом раствор наносили на слабую анионообменную смолу, находящуюся в ацетатной форме (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA). Несмотря на то, что сиалиллактоза редко связывается со смолой, дисиалиллактоза адсорбируется на смоле. Таким образом, сиалиллактозу элюируют 10 мМ ацетатом аммония, в то время как дисиалиллактозу элюируют 1 М ацетатом аммония. Для удаления ацетата аммония сиалиллактозу осаждают 10-кратным избытком этанола. Твердую фракцию отфильтровывали и сушили.

Окончательную обработку продукта производили пропусканием 20% раствора сиалиллактозы последовательно через фильтр с отсечением по массе 6 кДа (ультрафильтрационный модуль Pall Microza SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany) и стерилизующий фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Часть раствора сушили распылением с помощью устройства для распылительной сушки Buchi (Buchi Mini Spray Dryer B-290) (Buchi, Essen, Germany) при следующих параметрах: температура впускного отверстия: 130°С, выходная температура 67°С-71°С, поток газа 670 л/час, аспиратор 100%.

Чистота высушенной распылением 6'-сиалиллактозы составила 91%, в то время как чистота материала, содержащего 3'-сиалиллактозу, составила 93%.

Пример 5

Препараты смесей НМО

Смеси НМО были получены из твердых продуктов. Для этого единичные НМО сушили распылительной сушкой и смешивали полученные порошки. Смесь НМО I содержала 2'-фукозиллактозу и лакто-N-тетраозу в отношении 70% к 30%; смесь НМО II содержала 2'-фукозиллактозу (52%), 3-фукозиллактозу (13%), лакто-N-тетраозу (26%), 3'-сиалиллактозу (4%) и 6'-сиалиллактозу (5%). Смешанные порошки растворяли в воде, получая 20% раствор сахара, и вновь сушили распылительной сушкой в устройстве Buchi для распылительной сушки как описано в Примере 4.

Пример 6

Получение характеристик высушенных распылением олигосахаридов женского

молока

6.1 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

Термические изменения высушенных распылением олигосахаридов женского молока, а именно: 3-фукозиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалиллактозы, лакто-N-тетраозы, и высушенных распылением смесей олигосахаридов женского молока, смеси (смесь НМО I) 2'-фукозиллактозу и лакто-N-тетраозы и смеси (смесь НМО II) 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалиллактозы, соответственно, регистрировали способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с помощью калориметра Mettler Toledo 821е (Mettler Toledo, Giessen, Germany).

Калориметр Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Germany) применяли для определения термических изменений высушенных распылением продуктов (температуры стеклования (Tg), а также экзо- и эндотермических превращений).

Приблизительно 25 мг высушенных распылением олигосахаридов женского молока анализировали в гофрированных тиглях из Al (Mettler Toledo, Giessen, Germany). Образец охлаждали до 0°С со скоростью 10 К/мин и повторно нагревали до 100°С при скорости развертки, составляющей 10 К/мин. После охлаждения образцов до 0°С во втором цикле нагревания образцы повторно нагревали до 150°С. За температуру стеклования (Tg) принимали среднюю величину эндотермического сдвига базовой линии сканирования во время нагревания. Экзотермические и эндотермические пики обозначали в виде пиковых температур и нормализованной энергии изменения.

В первом цикле нагревания во всех образцах наблюдали основной переход в стеклообразное состояние в полном тепловом потоке, что было показано основной ступенью перехода на отрезке приблизительно 48-58°С; в большинстве образцов основной переход в стеклообразное состояние, наблюдаемый в первом цикле нагревания, повторялся во втором цикле нагревания. Результаты анализа ДСК представлены в Таблице 4.

В первом цикле нагревания был обнаружен пик эндотермической релаксации 3-фукозиллактозы после достижения Tg. Tg лакто-N-тетраозы, обнаруженная во втором цикле нагревания и составляющая приблизительно 79°С, была гораздо выше Tg других образцов. Это может быть вызвано эндотермическим изменением во время первого цикла нагревания, происходящим при приблизительно 89°С (-6,04 Дж/г). Как и у 3-фукозиллактозы, пик эндотермической релаксации 6'-сиалиллактозы был обнаружен после достижения Tg, однако в этом образце при 77°С (-0,22 Дж/г) происходило дополнительное эндотермическое изменение. В 3'-сиалиллактозе и смеси НМО I эндотермические изменения не были обнаружены, и в смеси НМО II эндотермическое изменение происходило в течение первого цикла нагревания при 79°С (0,34 Дж/г).

6.2 Порошковый рентгеноструктурный анализ

Для исследования морфологии лиофилизированных продуктов применяли широкоугольный порошковый рентгеноструктурный анализ (англ. X-ray powder diffraction, сокращенно XRD). Для анализа применяли рентгеновский дифрактометр Empyrean (Panalytical, Almelo, The Netherlands), снабженный медным анодом (45 кВ, 40 мА, эмиссия K_α1 при длине волны 0,154 нм) и детектор PIXcel3D. Приблизительно 100 мг высушенных распылением образцов анализировали в отраженном свете в диапазоне углов 2θ от 5 до 45° с шагом 2θ, составляющим 0,04°, и при времени подсчета 100 секунд за шаг.

Все отдельно взятые олигосахариды, а также смеси НМО I и II имели полностью аморфное состояние (Фиг. 1-6). Для лакто-N-тетраозы второй (аморфный) сигнал был обнаружен в диапазоне приблизительно 9-10°.

6.3 Лазерная дифракция

Размер частиц порошка оценивали способами лазерной дифракции. Система обнаруживает рассеянный и отраженный свет с помощью массива концентрически расположенных сенсорных элементов. Затем алгоритм программного обеспечения аппроксимирует импульсы частиц, вычисляя величины z интенсивности света, который попадает на различные сенсорные элементы. Анализ выполняли с помощью устройства для определения размера агрегатов SALD-7500 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) системы лазерной дифракции (qLD) для количественных определений.

Небольшое количество (на кончике шпателя) каждого образца диспергировали в 2 мл изооктана и гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение пяти минут.Дисперсию переносили в электролизер периодического действия, заполненный изооктаном, и анализировали в ручном режиме.

Сбор данных выполняли при следующих параметрах: усреднение сигнала за измерение по импульсам: 128, импульсы для накопления сигнала: 3, и интервал: 2 секунды.

Перед измерениями систему заполняли изооктаном. На каждом образце дисперсии измерения проводили 3 раза, вычисляя средние значения и стандартное отклонение. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения WING SALD II, версия V3.1. Поскольку показатель преломления образца был неизвестен, для определения профилей распределения размера использовали показатель преломления частиц сахара (дисахарида) (1,530). Получали значения среднего и срединного диаметра.

Средние размеры частиц во всех образцах были очень близки, лишь для смеси НМО II были получены несколько более низкие значения. Характеристики размеров частиц представлены в Таблице 5. Кроме того, из распределения размера частиц следует наличие одной популяции частиц основного размера во всех образцах.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложенная питательная композиция содержит высушенный распылением порошок, который содержит по меньшей мере 80% масс. 3-фукозиллактозы, полученной микробной ферментацией. Причем высушенный распылением порошок содержит 15% масс. воды или менее. Причем питательная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный олигосахарид человеческого молока (НМО), причем указанный один дополнительный НМО является сиалилированным НМО. Также предложен способ получения высушенного распылением порошка для питательной композиции. Изобретение направлено на получение порошка с низкой гигроскопичностью, в котором 3-фукозиллактоза находится в аморфной форме и имеет одинаковый размер частиц. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Питательная композиция, содержащая высушенный распылением порошок, который содержит по меньшей мере 80% масс. 3-фукозиллактозы, полученной микробной ферментацией, где высушенный распылением порошок содержит 15% масс. воды или менее, и причем питательная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный олигосахарид человеческого молока (НМО), причем указанный один дополнительный НМО является сиалилированным НМО.

2. Питательная композиция по п. 1, содержащая еще по меньшей мере один дополнительный НМО, где указанный по меньшей мере один дополнительный НМО представляет собой нейтральный НМО.

3. Питательная композиция по п. 2, в которой по меньшей мере один нейтральный НМО выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы и лакто-N-фукопентаозы I.

4. Питательная композиция по любому из пп. 1-3, в которой по меньшей мере один сиалилированный НМО выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы LST-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраозы.

5. Питательная композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанная питательная композиция содержит по меньшей мере один пробиотический микроорганизм.

6. Питательная композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанный высушенный распылением порошок содержит по меньшей мере 85% масс., по меньшей мере 90% масс., по меньшей мере 93% масс., по меньшей мере 95% масс. или по меньшей мере 98% масс 3-фукозиллактозы.

7. Питательная композиция по любому из пп. 1-6, в которой 3-фукозиллактоза присутствует в аморфной форме.

8. Питательная композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что высушенный распылением порошок содержит 10% масс. воды или менее, предпочтительно 7% масс. воды или менее, более предпочтительно 5% масс. воды или менее.

9. Питательная композиция по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что указанный высушенный распылением порошок не содержит генетически модифицированных микроорганизмов и молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически измененных микроорганизмов.

10. Питательная композиция по любому из пп. 1-9, представляющая собой детскую питательную смесь.

11. Способ получения высушенного распылением порошка для питательной композиции по любому из пп. 1-10, где способ включает следующие стадии:

a) очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона;

b) предоставление водного раствора, содержащего 3-фукозиллактозу стадии а); и

c) подвергание указанного раствора стадии b) распылительной сушке.

12. Способ по п. 11, в котором стадия а), представляющая собой очистку 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона, включает в качестве первой стадии:

i) удаление микробных клеток из ферментационного бульона с получением осветленного технологического потока;

и стадия а) дополнительно включает необязательно одну или более следующих стадий:

ii) подвергание указанного осветленного технологического потока по меньшей мере одной ультрафильтрации;

iii) по меньшей мере однократная обработка указанного осветленного технологического потока катионообменной смолой и/или по меньшей мере однократная обработка анионообменной смолой;

iv) подвергание указанного осветленного технологического потока по меньшей мере одной нанофильтрации и/или диафильтраци;

v) подвергание указанного осветленного технологического потока по меньшей мере одному электродиализу;

vi) по меньшей мере однократная обработка указанного осветленного технологического потока активированным углем; и/или

vii) подвергание указанного осветленного технологического потока по меньшей мере один раз кристаллизации и/или осаждению.

13. Способ по п. 11 или 12, в котором водный раствор содержит 3-фукозиллактозу в количестве, составляющем по меньшей мере 20% масс./об., 30% масс./об., 35% масс./об. и до 45% масс./об., 50% масс./об., 60% масс./об.

14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, сушат распылением при температуре сопла, составляющей по меньшей мере 110°С, предпочтительно по меньшей мере 120°С, более предпочтительно по меньшей мере 125°С и менее 150°С, предпочтительно менее 140°С и более предпочтительно менее 135°С.

15. Способ по любому из пп. 11-14, в котором водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, сушат распылением при выходной температуре, составляющей по меньшей мере 60°С, предпочтительно по меньшей мере 65°С и менее 80°С, предпочтительно менее 70°С.