ШТАММ Lactobacillus delbrueckii TS1-06, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОИЗВОДСТВА ЖИДКОЙ МОЛОЧНОКИСЛОЙ ЗАКВАСКИ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУКТА ПИТАНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к штаммам лактобацилл, применяемых в медицинской и пищевой биотехнологии. Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 обладает выраженными антагонистическими свойствами по отношению к Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. В геноме штамма обнаружен ген, кодирующий синтез бактериоцина. Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 может быть использован в медицинской, пищевой и микробиологической промышленности для получения лекарственных препаратов и для приготовления продуктов питания.

Микрофлора человека представляет собой систему, состоящую из множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих соответствующие биотопы в организме человека. Ведущими микробиоценозами являются кишечник, урогенитальный тракт, легкие и кожа [1]. На микрофлору организма влияет множество факторов, среди них - различные заболевания, антибиотики, стрессы, нарушения режима питания, - все это приводит к развитию дисбактериоза. Потому для восстановления и поддержания свойственной для каждого конкретного индивидуума микробиоты является актуальным применение нового класса препаратов - пробиотиков, основу которых составляют определенные виды непатогенных для человека бактерий [2]. Так, сегодня известны пробиотические бактерии, используемые для производства как молочнокислых продуктов, так и лекарственных препаратов.

Известен штамм Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225, используемый в качестве средства против диареи. Он обладает способностью вытеснения патогенных бактерий из кишечных клеток, в особенности бактерий, ответственных за диарею [3], однако нет данных о спектре антагонистической активности данного штамма и его устойчивости к антибиотикам, которые зачастую применяются совместно с пробиотиками при лечении диареи.

Известен штамм Bifidobacterium longum РО-6, он обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, заквашивает молоко, обеспечивает нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов [4], однако он требует сложных сред для культивирования, анаэробных условий при выращивании и не является устойчивым к воздействию экстремальных факторов.

Известен штамм Lactobacillus delbrueckii subs, bulgaricus B-21, образующий симбиоз со штаммом Lactobacillus acidophilus А-41 и штаммом дрожжей Saccharomyces lactis S-11, и используемый для производства кисломолочных продуктов [5], однако по спектру антагонистической активности и спектру устойчивости к антибиотикам данный штамм уступает предлагаемому штамму.

Известен штамм Lactobacillus plantarum 8А-Р3, применяемый для производства пробиотика «Лактобактерин» [6]. Он применяется для лечения и профилактики заболеваний жуледочно-кишечного тракта, лечебный эффект данного пробиотика обусловлен антагонистическим действием лактобактерий к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, однако предлагаемый штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 обладает более сильным эффектом в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, чем штамм Lactobacillus plantarum 8А-Р3.

Известны другие штаммы Lactobacillus delbrueckii, так, например, штамм Lactobacillus delbrueckii В-8744, однако он используется как продуцент молочной кислоты [7].

Известен наиболее близкий по техническому результату к заявленному штамму штамм Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus (штамм АТСС 11842 / DSM 20081) [8], выбранный в качестве прототипа. Он выделен в 1919 году из болгарской простокваши и применяется совместно с термофильным стрептококком для производства йогурта. Известный штамм эффективен при желудочно-кишечных растройствах и способен сбраживать молоко с образованием питательных молочнокислых продуктов.

Недостатками штамма, выбранного в качестве прототипа, являются более низкая скорость роста по сравнению с предлагаемым штаммом, в результате использования которого можно существенно снизить время культивирования; отсутствие данных о спектре антагонистической активности известного штамма и устойчивости к экстремальным факторам (низкая кислотность, содержание желчи).

Заявленный новый штамм - Lactobacillus delbrueckii TS1-06, выделенный из кисломолочной закваски, используемой для получения простокваши, имеет более высокие технологические характеристики по сравнению с известным штаммом, выбранном в качестве прототипа.

Техническим результатом заявленного изобретения является более высокая скорость роста, широкий спектр антагонистической активности по отношению к грамположительным и грамотрицательным патогенным бактериям, устойчивость к антибиотикам, продуцирование антибиотикоподобных веществ (бактериоцинов).

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 был получен путем множественных пересевов индивидуальных колоний лактобацилл на плотных питательных средах с последующим выяснением антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и молекулярно-генетических характеристик отдельных клонов. В результате был отобран клон, идентифицированный как штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06.

Полученный штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 депонирован в ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН под регистрационным номером «№1071 ГУНИИЭМ». Адрес коллекции ГУ НИИ экспериментальной медицины: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12. Уведомление прилагается к материалам данной заявки.

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» был многократно опробирован в лабораторных условиях на базе Научно-Исследовательского Института Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук (НИИЭМ РАМН). Как показали результаты микробиологических исследований, заявленный штамм обладает многими качественными характеристиками, превышающими известный мировой уровень.

1.Культурально-морфологические признаки штамма

Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ».

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» относится к семейству Lactobacillaceae, виду Lactobacillus, подвиду delbrueckii согласно определителю бактерий Берджи [9]. Клетки бактерий палочковидные, правильной формы, соединены в цепочки. В жидкой среде средний размер цепочки - 3 бациллы. Бактерии относятся к грамположительным, спор не образуют. Размер клеток - 0,5-1,2×3,0-10,0 мкм.

На фиг.1 представлено изображение штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 (увеличение в 1350 раз), выращенного на плотной среде МРС (НИЦФ, Россия) в течение 48 часов при 37°С.

При выращивании на 1,5% молоке (посевная доза 1%) при температуре 37°С заквашивание молока происходит на 8 час культивирования; при выращивании на бульоне МРС (Hi Media, Индия) в течение 24 часов при температуре 42°С образуется равномерная муть и осадок на дне; при росте в плотной среде - полупрозрачные бежевые колонии в форме гречишного зерна 1,0-1,5 мм в диаметре. На поверхности плотной агаризованной при росте в течение 24-48 часов при температуре 37°С среды формируются неправильной формы, слабовидные, полупрозрачные бежевые колонии диаметром 1-1,5 мм. Край колоний неровный, поверхность - неровная, слабо блестит, консистенция - мягкая. Рост по штриху - слабый. Пигментов, дифундирующих в среду, штамм не образует.

2. Физиолого-биохимические признаки штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ».

Отношение к кислороду:

Факультативный анаэроб.

Общие биохимические свойства:

Каталазоотрицательный, цитохромов не содержит.Нитраты не редуцирует; желатину не разжижает. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический.

Характер роста на средах с молоком:

Молоко сбраживает с образованием творожистого неплотного сгустка белого цвета. При выращивании в течение 7 часов pH снижается до 5,5; через 24 часа культивировании pH снижается до 4,5.

Особенности роста:

Температурный оптимум 37±2°С. Растет при 30°С. Оптимальное значение pH среды 5,5-6,0. Сохраняет жизнеспособность в диапазоне pH от 2,5 до 10. Растет при содержании желчи в среде до 2,5%.

Антагонизм к другим бактериям:

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» проявляет выраженные антагонистические свойства по отношению к Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Антагонистическая активность Lactobacillus delbrueckii TS1-06 по отношению к перечисленным видам микроорганизмов представлена на фиг.2, на которой изображена минимальная ингибирующая концентрация антагониста, при которой происходит подавление роста индикаторных культур. Так, например, как видно из фиг.2, необходимо около 10⁵ в 1 мл клеток Lactobacillus delbrueckii TS1-06, чтобы подавить рост 10⁸ в 1 мл клеток Enterococcus faecalis.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» выращивают при 37±2°С в среде на основе соевого белка (1.5%) "Supro Plus 2640" (Protein Technologies International) или в молоке с 1.5% жира. Для приготовления среды на основе "Supro Plus 2640" к 15 г соевого белка добавляют 1 литр воды, доводят pH до 7,0 и стерилизуют автоклавированием под давлением 1 атм 20 минут при 110-120°С. Коммерчески приобретенное молоко с 1.5% жирности стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре 110-120°С.

Для выращивания индивидуальных колоний штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 используют 1% агар МРС-4 (Ман, Рогоза, Шарп) (НИЦФ, Россия).

Для проведения анализов, требующих прозрачные среды для выращивания, используют бульон МРС (Hi Media, Индия). Культивирование проводят при 37±1°С в течение 24-48 часов.

Способ, условия и состав сред для хранения штамма:

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» хранят в стерильном обезжиренном молоке при 4°С с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней, либо в сублимированном виде в запаянных ампулах (длительность хранения 2 года и более). Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, pH 7,0. Возможно хранение в замороженном виде при -70°С в течение 6 месяцев.

Свойства штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» стабильны и не меняются при хранении, в процессе культивирования и при воздействии экстремальных факторов, что позволяет судить об его промышленной применимости.

Стабильность сохранения полезного свойства при длительном культивировании штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06:

Длительность культивирования штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 на жидких и агаризованных питательных средах (не менее 20 пересевов) не сопровождалось изменением спектра устойчивости к антибиотикам, антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам и другим признакам штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06, перечисленным выше.

3. Генетическая характеристика штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06:

Для облегчения видовой идентификации природного штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 как вида семейства Lactobacillaceae - Lactobacillus delbrueckii, участок хромосомной ДНК предлагаемого штамма был исследован методами молекулярной генетики и впоследствии был идентифицирован и сравнен с аналогичными участками других видов микроорганизмов.

ДНК штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ», соответствующая области кодирования рибосомального оперона (16S РНК), была просеквенирована методом Sanger. В результате установлена нуклеотидная последовательность, которая позволяет идентифицировать данный штамм в любых препаратах или продуктах, его содержащих.

TTCGGGTGCTTAAAATGCCAGTCGAGCGAGCTGAATTCAAAGATTCC

TTCGGGATGATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACG

TGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCT

AATACCGGATAACAACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGG

CGTATGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTTGTTGGT

GGGGTAAAGGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAAA

Данная последовательность при сравнении с банком данных нуклеотидных последовательностей Genbank характеризуется гомологией 99% с другими штаммами Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - 97%, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis - 98%, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii - 97%. Таким образом, предлагаемый штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 можно легко идентифицировать по вышеприведенной, свойственной только для этого штамма последовательности ДНК. Данная нуклеотидная последовательность была депонирована в банк данных нуклеотидных последовательностей GenBank NCBI и ей присвоен номер bankit1046222. Копия учетной записи из оригинальной базы данных GenBank NCBI прилагается к материалам данной заявки.

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 под «№1071 ГУНИИЭМ» содержит ген, кодирующий синтез лактоцина В. Наличие гена подтверждается полимеразной цепной реакцией с ДНК праймерами на данный ген. Можно предположить, что наличием данного генов обусловлена антагонистическая активность данного штамма.

Пример 1.

Результаты анализа ДНК культуры штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 на наличие в геноме генов, кодирующих синтез бактериоцинов.

Для проведения опыта по определению наличия генов, кодирующих синтез наиболее часто встречающихся у лактобацилл бактериоцинов, с помощью компьютерной программы «BLAST» [11] были сконструированы праймеры на изучаемые гены (таблица 1).

Таблица 1. Кодируемый ген Нуклеотидная последовательность праймеров прямой обратный плантарицин ccacctgtgaactagcagca agctgctgcgtaccaagatt лактацин F gagtcttggcaacggaagaagt gatgcggcttaactgttcgata лактацин В gttaaggaccaattgccagacc atgtcttcgtcagtttcgtgga лактацин S ggaagggaggtggaacagtatg cagacgcagttggcaataattc

С использованием этих праймеров была поставлена полимеразная цепная реакция (ПЦР) (30 циклов при температуре синтеза 58°С). В результате реакции амплификации и детекции ее результатов с помощью электрофореза было установлено, что в геноме штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 имеется ген, кодирующий синтез лактоцина В.

На фиг.3 представлен электрофорез результатов ГПЦР с праймерами на ген лактоцина В, где цифрой 1 обозначена полоса, соответствующая гену лактоцина В (250 п.н.), цифрой 2 обозначен маркер молекулярного веса по 100 п.н. На фиг.3 видно, что полученный фрагмент ДНК имеет размер около 250 нуклеотидных пар, что соответствует размеру ожидаемого в результате амплификации фрагмента. Размер ожидаемого фрагмента был рассчитан с помощью компьютерной программы «BLAST» [11].

4. Вирулентность:

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 был изолирован из простокваши и является безвредным для человека и животных. Молочнокислую закваску, полученную заквашиванием молока данным штаммом, в течение месяца употребляли в пищу волонтеры из числа сотрудников отдела молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН. В результате данного исследования побочных эффектов выявлено не было.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06.

Пример 2.

Результаты выращивания жидкой культуры штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 в условиях микробиологической лаборатории.

Для получения посевного материала в ампулу с лиофилизированной культурой, содержащей 10 мг сухого вещества, добавляют 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9%. Посевной материал получают выращиванием микробной культуры штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 на поверхности агаризованной среды МРС (Hi Media, Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 24-48 часов. Индивидуальные клоны штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06, выросшие на поверхности агара, помещаются в бактериологические пробирки, содержащие 7 мл среды "Supro Plus 2640" или молока, и выращиваются в термостате при 37°С в течение 18-24 часов. Выросшие в жидкой среде лактобациллы обуславливают сквашивание молока или среды "Supro Plus 2640". Из аликвот, взятых из полученной культуры, готовят мазки, окрашенные метиленовой синью. В мазках должны обнаруживаться одиночные и соединенные в цепочки палочки размером 0,8×5,0-10 мкм. В препаратах не должно быть посторонней микрофлоры. Полученный посевной материал используют для получения стартовой биомассы. Посевной материал вносят во флаконы, содержащие 300-500 мл стерильного молока, в количестве 5% и выращивают при 37°С в течение 14-16 часов. Стартовая биомасса может быть использована для выращивания больших объемов биомассы для производства жидких молочнокислых заквасок на основе штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 или сухих бактериосодержащих продуктов.

Пример 3.

Результаты исследования штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 по характеру антагонизма к патогенным бактериям.

Для определения антагонистической активности штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 использовался метод двухслойного агара [10]. Предварительно выращенную в течение 12-18 ч исследуемую культуру в различных концентрациях помещали в агаризованную среду МРС, формируя нижний слой. Для этого проводили ряд последовательных разведений культур в стерильном 0,5% водном растворе NaCl. Затем 1 мл суспензии клеток помещали в 9 мл агаризованной среды, охлажденной до 45°С. После застывания сверху наносили триптозный агар (10 г/л триптон (Difco, США), 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, рН 7,0) в количестве 10 мл. Через 24 ч инкубации засевали по 10 мкл индикаторных культур (Klebsiella pneumoniae cl. is., Enterococcus faecalis ATCC 29212, E.coli ATCC 25922, E.coli M15, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Pseudomonas aeruginosa cl. is., Candida albicans ATCC 869) в количестве 3×10⁸ КОЕ/мл. Засеянные среды инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Антагонистическую активность исследуемых культур выражали минимальной ингибирующей концентрацией антагониста (МИКА) - это минимальное количество антагониста, ингибирующего размножение патогенных бактерий и грибов. Показатели минимальной ингибирующей концентрации штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 представлены в таблице 2.

Таблица 2. Индикаторная культура МИКА, lg КОЕ/мл Klebsiella pneumoniae cl. is. 4,15±0,02 Enterococcus faecalis ATCC 29212 5,15±0,02 E.coli ATCC 25922 5,15±0,02 E.coli M15 2,15±0,02 Staphylococcus aureus ATCC 25923 4,15±0,02 Staphylococcus aureus 209 4,15±0,02 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4,15±0,02 Pseudomonas aeruginosa cl. is. 2,15±0,02 Candida albicans ATCC 869 -

Полученные результаты исследования антагонистической активности штамма Lactobacillus delbrueckii TS1-06 свидетельствуют о том, что данный штамм характеризуется высоким уровнем антагонизма к показанным штаммам.

Как показали результаты исследований в течение более двух лет, заявленный новый штамм молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus delbrueckii TS1-06 показал стойкие качественные характеристики, являющиеся преимуществом для использования в промышленном производстве, и может стать основой для создания новых лекарственных препаратов и пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения, которые будут иметь терапевтическую эффективность. Заявленный штамм соответствует указанному техническому результату и обладает выраженными антагонистическими свойствами по отношению к грамотрицательным и грамположительным патогенным микроорганизмам, устойчив к антибиотикам, в его геноме обнаружен ген, кодирующий синтез антибиотикоподобного вещества (бактериоцина).

Использованная литература

1. Дисбиоз кишечника: руководство по диагностике и лечению / Под ред. Е.И.Ткаченко и А.Н.Суворов. - СПб: 2006. - 196 с.

2. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: ГрантЪ, 1998, 416 с.

3. Патент РФ 2126446 С1, опубликован 20.02.1999, приоритет с 06.07.1993.

4. Патент РФ 2317326 С1, опубликован 20.02.2008, приоритет с 13.07.2006.

5. Патент РФ 97116294 А, опубликован 27.03.1999, приоритет с 26.09.1997.

6. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией. Журн. микробиол. 2004. №1. С.84-92.

7. Патент РФ 2004129918 А, опубликован 27.03.2006, приоритет с 14.10.2004.

8. Belgian co-ordinated collections of micro-organisms, Belgian Federal Science Policy, Wetenschapsstraat 8 Rue de la Science B-1000, Brussels http://bccm.belspo.be/db/lmg_search_form.php (прототип).

9. Определитель бактерий Берджи, Москва, изд-во Мир, 1997, т.2, с.574

10. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - №5. - С.94-98.

11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 выделен из кисломолочной закваски, используемой для получения простокваши. Полученный штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 депонирован в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова под регистрационным номером 497 KM МГУ. Штамм используют для изготовления бактериальных препаратов и производства жидкой молочнокислой закваски в качестве продукта питания лечебно-профилактического назначения. Это обеспечивает высокую скорость роста, широкий спектр антагонистической активности по отношению к грамположительным и грамотрицательным патогенным бактериям, содержание желчи, устойчивость к антибиотикам, продуцирование антибиотикоподобных веществ (бактериоцинов). 3 ил., 2 табл.

Штамм Lactobacillus delbrueckii TS1-06 депонирован в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова под регистрационным номером 497 KM МГУ, используемый для изготовления бактериальных препаратов и производства жидкой молочнокислой закваски в качестве продукта питания лечебно-профилактического назначения.