СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2010 года по МПК C12N5/07 A61P31/06 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способу лечения экспериментального туберкулеза легких у животных.

Заболеваемость туберкулезом растет во всем мире. По данным ВОЗ треть населения планеты инфицирована микобактерией М. tuberculosis. В России ежегодно регистрируется 75-85 тысяч впервые выявленных больных туберкулезом. Из общей смертности от инфекционных заболеваний до 75% составляет смерть от туберкулеза. Лечение туберкулеза - длительный процесс, проводимый с использованием одновременно 4-5 противотуберкулезных препаратов в течение 6-12 месяцев, а иногда и более, которые принимаются ежедневно. При этом часто у больных возникают различные побочные явления, а эффективность излечения колеблется в пределах

50-80% случаев. В связи с этим является актуальным отыскание новых средств, пригодных для лечения и профилактики туберкулеза, которые не давали бы тяжелых побочных эффектов.

Известен способ лечения туберкулеза легких путем введения гомогената ксеногенной поджелудочной железы подкожно однократно в дозе 0,2-0,3 мл при использовании стандартной химиотерапии в течение нескольких месяцев.

Задачей настоящего изобретения является отыскание новых средств, пригодных для лечения туберкулеза, а также повышение эффективности способа лечения туберкулеза.

Авторами настоящего изобретения в процессе исследований in vivo и in vitro было обнаружено, что в качестве такого средства могут быть использованы клетки костного мозга (ККМ).

В отличие от указанного в АС РФ SU 1727840 A1 эффективность введения только ККМ в соответствии с настоящим изобретением была подтверждена как в условия in vivo (выживаемость), так и в условиях in vitro (высеваемость микобактерий туберкулеза - МБТ). Исследования действия ККМ проводились in vivo на мышиной модели активного экссудативно-некротического туберкулеза.

Определить показатель выживаемости животных после заражения их смертельной дозой микобактерий туберкулеза H₃₇Rv и показатель высеваемости МБТ из органов зараженных животных.

Исследованию подвергались клетки костного мозга (КММ) инбредной линии мышей AKR, резистентной к туберкулезу, содержащейся в питомнике Государственного Учреждения Центрального научно-исследовательского института туберкулеза Российской Академии медицинских наук (ГУ ЦНИИТ РАМН). Вес мышей - 20 граммов. Возраст - 2 месяца. Изучение действия ККМ проводили на самцах инбредной линии мышей C57BL/6, чувствительной к туберкулезу, полученных из того же питомника. Вес мышей - 20 граммов. Возраст - 3 месяца. Мышей заражали внутривенным введением М. tuberculosis штамма H₃₇Rv из коллекции института Пастера (Франция) в ретроорбитальный синус глаза в дозе 1×10⁷ КОЕ. В препаративных количествах МБТ были получены в лаборатории иммуногенетики указанного института. Аликвоты (1 мл) хранили при -70°С. Для определения количества КОЕ микобактерий в полученной суспензии отбирали аликвоту, готовили серию последовательных разведений и 20 мкл каждого разведения помещали в капле на чашку Петри с агаром Дюбо. Чашки культивировали при 37°С в течение 14 суток для определения концентрации МБТ в инфицирующем материале. Для заражения мышей аликвоту размораживали, переводили в фосфатно-буферный раствор, содержащий 0.025% Твина 80, и доводили до концентрации 1×10⁷ КОЕ/мл. Клетки костного мозга получали из бедренной кости мышей, суспендировали в среде 199 и доводили до концентрации 6 млн клеток в 0,3 мл среды 199 на 1 инъекцию на мышь.

Все экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1 группа - интактные животные - 10 шт.

2 группа - инфицированные животные, не получающие лечения, - 10 шт.

3 группа - инфицированные животные, получающие противотуберкулезный препарат изониазид в дозе 38,5 мг/кг, - 10 шт.

4 группа - инфицированные животные, получающие противотуберкулезный препарат изониазид в дозе 38,5 мг/кг и ККМ (6 млн клеток на мышь), - 10 шт.

5 группа - инфицированные животные, получающие только ККМ (6 млн клеток на мышь), - 10 шт.

Изониазид вводили внутрижелудочно ежедневно в течение 2-х месяцев через 3 дня после заражения. ККМ вводили внутривенно в хвостовую вену мышей еженедельно в течение 2-х месяцев.

Основными показателями резистентности животного к туберкулезу являются срок выживаемости после инфицирования и число высеваемых микобактерий из органов зараженных экспериментальных животных.

У мышей контрольной группы, не получавших никаких препаратов, выживаемость после смертельной дозы заражения составила в среднем 24 дня. Мыши, получавшие ежедневно изониазид в течение 2-х месяцев (3 группа), изониазид и ККМ одновременно (4 группа) и только ККМ (5 группа), оставались живы в течение всего срока наблюдения - 4 месяца (таблица 1).

Таблица 1 Сроки выживания мышей, зараженных МБТ, в зависимости от вида ККМ   Без лечения Изониазид Изониазид + ККМ ККМ Дни 24,1±1,9 120±0 120±0 120±0

После окончания лечения, через 4 месяца после заражения, часть животных была забита для оценки высеваемости МБТ из органов мышей. Результаты высеваемости МБТ представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты высеваемости МБТ из органов зараженных животных (КОЕ) Дни Препараты Селезенка Легкие 24 Без лечения (2,6±0,9)×10⁹ (5,5±1,9)×10⁹ 120 ККМ (2,9±0,4)×10⁵ (9,3±2,3)×10⁵   ПТП (5,8±1,2)×10³ 0   ПТП + ККМ (5,3±3,2)×10³ 0

Как видно из таблицы, даже по прошествии 2-х месяцев после окончания трансплантации аллогенных ККМ число МБТ в органах было значительно снижено по сравнению с животными без лечения, которые погибли через 24 дня. На первом разведении клеточной суспензии легких мышей из групп 3 и 4 не удалось выявить выросшие колонии МБТ.

Таким образом, трансплантация чувствительным к туберкулезу мышам аллогенных ККМ от резистентной к туберкулезу линии мышей позволила значительно продлить жизнь зараженным экспериментальным животным.

Литература

1. Г.В.Терентьев, В.И.Голышевская, О.А.Уварова. Авторское свидетельство SU 1727840 А1.

2. Ortiz L.A. PNAS 2003; 14: 8407-11.

3. Kotton D.N. et al. Development 2001; 128: 5181-8.

4. Simonelli C., Michieli M. Blood 2005; 105; 2: 439-440.

5. Krishnan A. et al. Blood 2005; 105; 2: 874-878.

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, ветеринарии и медицине. Способ лечения экспериментального туберкулеза у мышей предусматривает введение суспензии клеток костного мозга больным мышам. Клетки костного мозга выделяют из бедренной кости инбредной линии мышей AKR, резистентной к туберкулезу. Введение осуществляют в хвостовую вену один раз в неделю в дозе 6 млн клеток на мышь в течение двух месяцев. Способ позволяет значительно снизить число микобактерий в организме опытных животных и гарантированно продлить жизнь зараженным животным. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине. 2 табл.

Способ лечения экспериментального туберкулеза у мышей, включающий введение мышам суспензии клеток костного мозга, выделенных из бедренной кости инбредной линии мышей AKR, резистентной к туберкулезу, в хвостовую вену один раз в неделю в дозе 6 млн клеток на мышь в течение двух месяцев.