СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C12P19/34 C07H21/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений.

Известные способы получения РНК из дрожжей позволяют выделять низкополимерную РНК, например, патент РФ №2103365, патент РФ №1708845 [1], [2]. Она применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.) [3]. Однако этот препарат вводится пациентам всегда перорально и механизм его действия включает, скорее всего, поставку мономеров для синтеза эндогенных нуклеиновых кислот. Механизм действия высокополимерной дрожжевой РНК принципиально иной. Она гораздо менее токсична чем низкополимерная и вводится животным путем инъекций, что приводит к избирательной индукции синтеза некоторых белков, например гемоглобина (Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - №3(121). - С.117-121) [4].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в водном 0,3-1,2 М растворе 2-этилгексановой кислоты, содержащем 0,1-0,5 М NaCl (pH - 7,0-7,5), суспензию выдерживают при 92-98°C в течение 10-40 мин, охлаждают до комнатной температуры, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин при 0-4°C, к надосадочной жидкости добавляют этанол до содержания 50-55 об.%, центрифугируют (4000 об/мин, 15 мин, 0-4°C), полученный осадок суммарной РНК растворяют в воде до содержания 150-200 ОЕ₂₆₀/мл. Раствор осветляют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 20 мин при 0-4°C. Затем к надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2 М, выдерживают смесь при 0-4°C в течение 1-2 ч и осадок высокополимерной РНК отделяют путем центрифугирования, растворяют до 150-200 ОЕ₂₆₀/мл, после центрифугирования полученного раствора (20000 об/мин, 20 мин, 0-4°C) к надосадочной жидкости добавляют NaCl до содержания 1,5 М и этанол до содержания 50-55 об.%. Осадок натриевой соли РНК собирают центрифугированием при 0-4°C, к надосадочной жидкости добавляют NaCl до 0,1-0,5 М и этанол до содержания 50-55 об.%, полученный осадок высокополимерной РНК отделяют и высушивают обычными методами (а.с. SU 936701) [5].

Данный способ предполагает использование неприродного, редкого и высокотоксичного литического агента - 2-этилгексановой кислоты, что требует глубокой очистки конечного продукта, вследствие чего этот способ не экономичен и практически не масштабируем.

Целью изобретения является замена неприродного, редкого и высокотоксичного литического агента на пищевой крупнотоннажный, что существенно удешевляет процесс поскольку делает его практически безотходным.

Цель достигается тем, что дрожжи суспендируют в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до pH 7-8, суспензию выдерживают при 98-102°C в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре, надосадочную жидкость сливают с помощью сифона (из осадка путем упаривания может быть получен кормовой белок), затем к слитой жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-96 ч при комнатной температуре, центрифугируют (2500-3500 g, 5-15 мин, без охлаждения), полученный супернатант пригоден для извлечения низкополимерной РНК, а осадок промывают 2 порциями 2-3 М раствора NaCl и 5 порциями 92-96%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования (2500-3500 g, 5-15 мин, без охлаждения).

Из полученного шрота высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой и высушивают обычным методом, а из этанола путем его перегонки может быть получено дрожжевое масло.

Таким образом, наряду с целевым продуктом - высокополимерной РНК, попутно можно получить концентрат кормового белка, низкополимерную РНК и дрожжевое масло.

При снижении центробежного ускорения ниже 2500 g и времени центрифугирования менее 5 мин осадок высокополимерной РНК образуется рыхлый и тянется за декантируемым супернатантом, а увеличение ускорения более 3500 g и времени центрифугирования более 15 мин не приводит к дополнительному его уплотнению.

Пример осуществления предлагаемого способа

Экстракция РНК. 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Новосибирский дрожжевой завод, ТУ 9182-001-00367108-04) с содержанием влаги ~70% суспендировали по порциям в течение 20 мин в 2 л кипящей воды, содержащей 45 г олеиновой кислоты, оттитрованной 20 мл 2,5 М NaOH так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98°C. Суспензию кипятили 40 мин при 98-102°C и частом перемешивании. По мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 3 л. Через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию добавляли по 10 мл 2,5 М NaOH. По окончании экстракции в горячую суспензию добавляли кипящую воду до 4,5 л, перемешивали, переносили в узкий цилиндрический сосуд на 5 л из термостойкого стекла, в котором она и отстаивалась при комнатной температуре в течение 22 ч.

Высаливание высокополимерной РНК и сбор концентрата кормового белка. Отстоявшийся супернатант (2,9 л) сливали с помощью сифона в стеклянную емкость на 5 л. Киселеобразный дрожжевой шлам, собирающийся на дне сосуда и содержащий до 70% денатурированного белка, сушили при 58-62°C обычным способом. В супернатант же добавляли 620 г NaCl (ГОСТ Р 51574-2000 ФГУП комбината «СИБСОЛЬ», г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл.) и свежекипяченую воду до 3,5 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и ставили отстаиваться при комнатной температуре на 22 ч. При этом в нижней части суспензии формируется осадок.

Промывка высоленной высокополимерной РНК 3 М раствором NaCl и этанолом и осаждение из отходов 3 М раствора NaCl низкополимерной РНК концентрированной HCl. Далее высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатанта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2 порциями по 0,8 л 3 М раствора NaCl и 5 порциями по 200 мл 94%-ного этанола (Куйбышевский спиртовый завод, Новосибирская обл.); при этом шрот отделяли от 3 М раствора NaCl и этанола центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения). Отработанный спирт регенерировали перегонкой, при этом в остатке собиралось дрожжевое масло. Содержащуюся же в супернатанте (~3,5 л) из-под высокополимерной РНК низкополимерную РНК осаждали добавлением 7 мл концентрированной HCl. Сформировавшийся в течение 2 сут при температуре 5-25°С осадок низкополимерной РНК выделяли центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2 порциями по 400 мл 94%-ного этанола и сушили на воздухе при комнатной температуре.

Товарную высокополимерную РНК получали экстракцией ее из промытого шрота дистиллированной водой, осветлением экстракта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения) и заключительной лиофилизацией.

Из 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей получали 5-10 г высокополимерной РНК со следующими характеристиками: цвет лиофилизованного препарата - белый; растворимость в воде - хорошая; весовая экстинкция, ОЕ₂₆₀/мг - 16-20; содержание КРФ, % ≤2,5; прирост КРФ, % ≤0,5; спектральные отношения: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,25-0,55; D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,86-0,94; D₂₈₀/D_26o - 0,40-0,65.

Выход из 1 кг дрожжей концентрата кормового белка 250-270 г, низкополимерной РНК 1,2-2,4 г, дрожжевого масла 1-2 г.

Предложенный способ получения высокополимерной дрожжевой РНК (предполагаемое рыночное название «Виталанг») является практически безотходной, легко масштабируемой и простой технологией, поскольку предполагает использование крупнотоннажного и дешевого литического агента - олеиновой кислоты, являющейся к тому же незаменимым продуктом питания.

Источники информации

1. Патент РФ №2103365.

2. Патент РФ №1708845.

3. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.

4. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - №3(121). - С.117-121.

5. Авторское свидетельство SU №936701.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений. Предложенный способ получения высокополимерной РНК из дрожжей включает суспендирование дрожжей в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до pH 7-8, с последующим продолжительным кипячением суспензии. Далее отстаивают горячий лизат в течение 22 ч при комнатной температуре. После чего осаждают высокополимерную РНК из супернатанта хлористым натрием и промывают полученный шрот, содержащий высокополимерную РНК, последовательно 2 порциями 3 М раствора хлористого натрия и 5 порциями 94% этанола путем его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования. Предложенное изобретение позволяет получить целевой продукт - высокополимерную РНК.

Способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием и промывкой осадка раствором хлористого натрия и этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой, отличающийся тем, что дрожжи суспендируют в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до pH 7-8, суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40 мин, отстаивают горячий лизат в течение 22 ч при комнатной температуре, к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 3 М, суспензию выдерживают 20-96 ч при комнатной температуре, центрифугируют на низкоскоростной центрифуге при ускорении 3000 g в течение 10 мин без охлаждения, а полученный шрот, содержащий высокополимерную РНК, промывают последовательно двумя порциями 3 М раствором NaCl и пятью порциями 94%-ным этанолом путем его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования при ускорении 3000 g в течение 10 мин без охлаждения.