СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C12P19/34 C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к выделению физиологически активных соединений.

Известные способы выделения РНК из дрожжей позволяют получать низкополимерную РНК (патент РФ №2103365, патент РФ №1708845) [1, 2]. Она широко применяется в медицине при лечении различных заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985, 191 с.) [3]. Однако этот препарат вводится пациентам всегда перорально и механизм его действия включает, скорее всего, поставку мономеров для синтеза эндогенных нуклеиновых кислот. Механизм действия высокополимерной дрожжевой РНК принципиально иной. Она менее токсична, чем низкополимерная и вводится животным путем инъекций, что приводит к избирательной индукции синтеза некоторых белков, например гемоглобина (Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюл. Сибирского отделения РАМН, 2006, №3 (121), c.117-121) [4].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в 2%-ном водном растворе литического агента - додецилсульфата натрия (ДДС-Na), содержащем 4,5%-ный этанол, 0,0125 М NaH₂PO₄ и 0,0125 М Na₂HPO₄. Суспензию выдерживают при 83-94°С в течение 3 мин, охлаждают до ~4°С, центрифугируют при 2000 g в течение 30 мин при 0°С. К надосадочной жидкости добавляют 2 объема холодного этанола и выпавшую в осадок РНК центрифугируют (2000 g, 15 мин, охлаждение). Полученную сырую высокополимерную РНК промывают двумя порциями 67%-ного этанола, собирают центрифугированием (2000 g, 15-20 мин, охлаждение) и растворяют в воде. Раствор осветляют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин при 0°С. Затем к надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 1 М, выдерживают смесь при 0°С в течение 30 мин, осадок высокополимерной РНК отделяют путем центрифугирования (2000 g, 1 ч, охлаждение), промывают тремя порциями 67%-ного этанола и растворяют медленным добавлением воды. Раствор диализуют в течение 36 ч при 4°С против дистиллированной воды, муть удаляют фильтрованием через Celite и затем через асбест.Полученный раствор высокополимерной РНК лиофилизуют (Crestfield A.M., Smith K.C., Allen F.W. The preparation and characterization of ribonucleic acids from yest // J. Biol. Chem., 1955, v.216, N 1, P.185-193) [5].

Однако выделенный данным способом препарат высокополимерной РНК содержит значительное количество примесного высокомолекулярного рибопротеогликана, элюирующегося при гель-фильтрации на Сефарозе 4В во внешнем объеме (Ямковая Т.В., Хомов В.В., Загребельный С.Н., Ямковой В.И. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология, 2006, т.42, N 1, с.93-97) [6]. Эта примесь в корне изменяет биологические свойства РНК. В частности, высокополимерная РНК, содержащая высокомолекулярный рибопротеогликан в отличие от чистой высокополимерной РНК, не стимулирует гемопоэз у лабораторных животных (Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюл. Сибирского отделения РАМН, 2006, №3 (121), с.117-121) [4].

Целью изобретения является освобождение высокополимерной РНК от примесного высокомолекулярного рибопротеогликана, что достигается заменой «жесткого» центрифугирования по способу-прототипу на стадии осаждения высокополимерной РНК хлористым натрием (2000 g, 1 ч, охлаждение) на более «мягкое» центрифугирование (1500 g, 10 мин, без охлаждения). Осуществить такую замену нам удалось перенеся процедуру освобождения высокополимерной РНК от балласта с одной из первых стадий (см. способ-прототип, стадия осветления) на самую последнюю стадию, поскольку известно - чем больше осадок, тем при меньшем ускорении и меньшем времени центрифугирования его можно количественно осадить.

Цель достигается тем, что дрожжи суспендируют в водном 2-3%-ном растворе ДДС-Na, суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре, к слитой с помощью сифона надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют (1000-2000 g, 5-15 мин, без охлаждения), осадок промывают двумя порциями 2-3 М раствора NaCl и двумя порциями 92-96%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования (1000-2000 g, 5-15 мин, без охлаждения). Из полученного шрота (высокополимерная РНК плюс балласт) высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой, экстракт осветляют фильтрованием и лиофилизуют.

При снижении центробежного ускорения ниже 1000 g и времени центрифугирования менее 5 мин осадок высокополимерной РНК образуется рыхлый и плохо садится, а увеличение ускорения выше 2000 g и времени центрифугирования более 15 мин не приводит к дополнительному его образованию. Кроме того, при ускорении 2000 g и выше вместе с крупными хлопьями высокополимерной РНК соосаждается мелкая муть мало изученного высокомолекулярного рибопротеогликана.

Пример осуществления предлагаемого способа

День 1 - экстракция РНК. 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae. Новосибирский дрожжевой завод, ТУ 9182-001-00367108-04) с содержанием влаги ~70% суспендировали по порциям в течение 20 мин в 2 л кипящей дистиллированной воды, содержащей 75 г ДДС-Na (Научно-производственной фирмы «ДИА-ФАРМ», г.Белгород) так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98°С. Суспензию кипятили 40 мин при 98-102°С и частом перемешивании. По мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 3 л. По окончании экстракции в горячую суспензию добавляли кипящую воду до 4,5 л, перемешивали, переносили в узкую цилиндрическую емкость на 5 л из термостойкого стекла, в которой она и отстаивалась при комнатной температуре в течение 22 ч.

День 2 - высаливание РНК. Отстоявшийся супернатант (2,8 л) сливали с помощью сифона в стеклянную емкость на 5 л, добавляли в нее 810 г NaCl (ГОСТ Р 51574-2000, ФГУП комбината «СИБСОЛЬ, г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл.) и кипяченую воду до 4,5 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и оставляли при комнатной температуре на 22 ч. При этом в нижней части суспензии формируется осадок, а на ее поверхности укрупняются пузырьки высоленного воздуха.

День 3 - промывка высоленной РНК 3 М раствором NaCl и этанолом. Укрупненные пузырьки высоленного воздуха удаляли с поверхности суспензии легким постукиванием по верхней части стеклянной емкости или легким помешиванием верхней части суспензии. Далее, высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатанта центрифугированием (1500 g, 10 мин, без охлаждения), промывали двумя порциями по 2 л 3 М раствора NaCl и 2-мя порциями (1 и 0,5 л) 94%-ного этанола (Куйбышевский спиртовый завод, Новосибирская обл.); при этом шрот отделяли от 3 М раствора NaCl и этанола центрифугированием (1500 g, 10 мин, без охлаждения).

Товарную высокополимерную РНК получали экстракцией ее из промытого шрота дистиллированной водой, осветлением экстракта фильтрованием через стеклянный пористый фильтр «ПОР-100» и заключительной лиофилизацией.

Из 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей получали 5-10 г высокополимерной РНК со следующими характеристиками: цвет лиофилизованного препарата - белый; растворимость в воде - хорошая; весовая экстинкция, ОЕ₂₆₀/мг - 19-21; содержание КРФ, % ≤2,5; прирост КРФ, % ≤0,5; спектральные отношения: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,35-0,55; D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,86-0,94; D₂₈₀/D₂₆₀ - 0,4-0,55.

Предложенный способ получения высокополимерной дрожжевой РНК (предполагаемое рыночное название «Виталанг-1») является простой и легко масштабируемой технологией, поскольку в нем используются только самые низкоскоростные центрифуги без охлаждения и крупнотоннажный литический агент - ДДС-Na.

Источники информации

1. Патент РФ №2103365.

2. Патент РФ №1708845.

3. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985, 191с.

4. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюлл. Сибирского отделения РАМН, 2006, №3 (121), с.117-121.

5. Crestfield A.M., Smith K.C., Allen F.W. The preparation and characterization of ribonucleic acids from yest. // J. Biol. Chem., 1955, v.216, N 1, p.185-193.

6. Ямковая Т.В., Хомов В.В., Загребельный С.Н., Ямковой В.И. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология, 2006, т.42, N 1, с.93-97.

Способ предусматривает суспендирование дрожжей в водном 2-3%-ном растворе додецилсульфата натрия. Суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре. К слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М. Суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре. Центрифугируют на низкоскоростной центрифуге без охлаждения. Полученный шрот промывают последовательно двумя порциями 2-3 М раствора NaCl и двумя порциями 92-96%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования. Из полученного шрота РНК экстрагируют дистиллированной водой с последующим осветлением раствора путем фильтрования его через стеклянный пористый фильтр. Способ позволяет получить высокополимерную РНК, освобожденную от примесного высокомолекулярного рибопротеогликана. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в кипящем растворе литического агента додецилсульфата натрия (ДДС-Na) с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием и промывкой осадка раствором хлористого натрия и этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой, отличающийся тем, что дрожжи суспендируют в водном 2-3%-ном растворе додецилсульфата натрия (ДДС-Na), суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре, к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют на низкоскоростной центрифуге без охлаждения, полученный шрот промывают последовательно 2-3 М раствором NaCl и 92-96%-ным этанолом путем его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отстаивание горячего лизата проводят предварительно разбавив его кипяченой водой в соотношении дрожжи/вода 1/3-4.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкоскоростное центрифугирование осуществляют при ускорении 1000-2000 g в течение 5-15 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание шрота осуществляют последовательно не менее чем двумя порциями 2-3 М раствором NaCl и 92-96%-ным этанолом.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечную экстракцию высокополимерной РНК из шрота производят дистиллированной водой с последующим осветлением раствора путем фильтрования его через стеклянный пористый фильтр.