СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ СУХИХ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C12P19/34 C12N15/10 C12N1/18 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений.

Известные способы получения РНК из дрожжей позволяют получать низкополимерную РНК, например, патент РФ № 2103365, патент РФ № 1708845 [1], [2]. Она давно применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.) [3]. Однако этот препарат вводится пациентам всегда перорально, и механизм его действия включает, скорее всего, поставку мономеров для синтеза эндогенных нуклеиновых кислот. Механизм действия высокополимерной дрожжевой РНК принципиально иной. Она гораздо менее токсична, чем низкополимерная, и вводится животным путем инъекций, что приводит к избирательной индукции синтеза некоторых белков, например гемоглобина (Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - № 3(121). - C.117-121) [4].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокополимерной РНК из прессованных или предварительно замоченных сухих дрожжей путем суспендирования их в водном 0,3-1,2 М растворе 2-этилгексановой кислоты, содержащем 0,1-0,5 М NaCl (pH 7,0-7,5), суспензию выдерживают при 92-98°С в течение 10-40 мин, охлаждают до комнатной температуры, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин при 0-4°С, к надосадочной жидкости добавляют этанол до содержания 50-55 об.%, центрифугируют (4000 об/мин, 15 мин, 0-4°С), полученный осадок суммарной РНК растворяют в воде до содержания 150-200 ОЕ₂₆₀/мл. Раствор осветляют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 20 мин при 0-4°С. Затем к надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2 М, выдерживают смесь при 0-4°С в течение 1-2 ч и осадок высокополимерной РНК отделяют путем центрифугирования, растворяют до 150-200 ОЕ₂₆₀/мл, после центрифугирования полученного раствора (20000 об/мин, 20 мин, 0-4°С) к надосадочной жидкости добавляют NaCl до содержания 1,5 М и этанол до содержания 50-55 об.%. Полученный осадок натриевой соли высокополимерной РНК собирают центрифугированием при 0-4°С и высушивают обычными методами (а.с. SU 936701) [5].

Данный способ предполагает использование не природного, редкого и высокотоксичного литического агента - 2-этилгексановой кислоты, и обводненных дрожжей, что требует глубокой очистки сильно деградированного конечного продукта, вследствие чего этот способ не экономичен и практически не масштабируем.

Целью изобретения является замена не природного, редкого и высокотоксичного литического агента на крупнотоннажный пищевой, что существенно удешевляет процесс, поскольку делает его безотходным. Кроме того, для подавления активности лизосомальных рибонуклеаз мы предлагаем сыпать сухие дрожжи без предварительного их замачивания непосредственно в крутой кипяток раствора литического агента.

Цель достигается тем, что сухие дрожжи суспендируют в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до рН 7-8, суспензию выдерживают при 99-102°С в течение 40-60 мин, охлаждают до 35-45°С, центрифугируют (2500-3500 g, 5-15 мин, без охлаждения) и к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М. Суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют (2500-3500 g, 5-40 мин, без охлаждения), осадок промывают 2-мя порциями 2-3 М раствора NaCl и 3-5-ю порциями 92-97%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования (2500-3500 g, 5-40 мин, без охлаждения). Из полученного шрота высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой и высушивают обычным методом. Попутно получают концентрат кормового белка, низкополимерную РНК и природные олигорибонуклеотиды.

При снижении центробежного ускорения ниже 2500 g и времени центрифугирования менее 5 мин осадок высокополимерной РНК образуется рыхлый и тянется за декантируемым супернатантом, а увеличение ускорения более 3500 g и времени центрифугирования более 40 мин не приводит к дополнительному его уплотнению.

Пример осуществления предлагаемого способа

30 г свежих сухих пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Новосибирский дрожжевой завод, ГОСТ 28483-90) с содержанием влаги ~7,4% суспендировали по порциям в течение 1-2 мин в 0,3 л кипящей воды, содержащей 4,5 г олеиновой кислоты, оттитрованной 2 мл 2,5 М NaOH так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 99°С. Суспензию кипятили 40 мин при 99-102°С и частом перемешивании. По мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 0,3 л. Через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию добавляли по 1 мл 2,5 М NaOH. По окончании экстракции горячую суспензию охлаждали до ~40°С, центрифугировали (3000 g, 10 мин, без охлаждения), супернатант (~0,16 л) сливали в стеклянную емкость на 0,5 л. Дрожжевой шлам, собирающийся на дне центрифужных стаканов и содержащий до 70% денатурированного белка, сушили при 58-62°С обычным способом. В супернатант же добавляли 53 г NaCl (ФГУП комбината «СИБСОЛЬ», г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл., ГОСТ Р 51574-2000) и свежую дистиллированную воду до 0,3 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и оставляли при комнатной температуре на 22 ч. Высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатанта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2-мя порциями по 80 мл 3 М раствора NaCl и 4-мя порциями по 20 мл 96-97%-ного этанола (ОАО «Спиртовый комбинат», г.Мариинск, Кемеровская обл., ГОСТ Р 51652-2000); при этом шрот отделяли от 3 М раствора NaCl и этанола центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения). Отработанный спирт регенерировали перегонкой (возврат ~90%). Содержащуюся же в супернатанте (~0,3 л) из-под высокополимерной РНК низкополимерную РНК осаждали добавлением 0,6 мл концентрированной HCl. Сформировавшийся в течение 2 сут при температуре 5-25°С осадок низкополимерной РНК выделяли центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2-мя порциями по 35 мл 94%-ного этанола и сушили на воздухе при комнатной температуре. Природные олигорибонуклеотиды получали гель-хроматографией низкополимерной РНК на Сефарозе 4 В. Они элюировались 0,15 М раствором NaCl двумя пиками с К_av=1,33 и 1,58.

Товарную высокополимерную РНК получали экстракцией ее из промытого шрота дистиллированной водой, осветлением экстракта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения) и заключительной лиофилизацией.

Из 30 г свежих сухих пекарских дрожжей получали 0,70-1,35 г высокополимерной РНК со следующими характеристиками: цвет лиофилизованного препарата - белый; растворимость в воде - удовлетворительная, водный раствор мылкий; весовая экстинкция, ОЕ₂₆₀/мг - 17-18; содержание КРФ, % ≤2,5; прирост КРФ за 1 сут при 22-25°С в дистиллированной воде, % ≤0,4; спектральные отношения: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,30-0,45; D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,88-0,92; D₂₈₀/D₂₆₀ - 0,45-0,60.

Выход из 30 г свежих сухих пекарских дрожжей концентрата кормового белка - 24-26 г, низкополимерной РНК - 0,17-0,24 г, природных олигорибонуклеотидов - 15-21 мг.

Предлагаемый способ получения высокополимерной дрожжевой РНК (предполагаемое рыночное название «Виталанг-2») является простой, легко масштабируемой, экологически чистой и практически безотходной технологией, поскольку предполагает использование сухих дрожжей и крупнотоннажного и дешевого литического агента - олеиновой кислоты, являющейся, к тому же, незаменимым продуктом питания.

Весовая экстинкция, характеризующая степень чистоты полученной предлагаемым способом высокополимерной РНК (17-18 ОЕ₂₆₀/мг), практически соответствует таковой (>16 ОЕ₂₆₀/мг) для препарата высокополимерной РНК сорта А, полученного по способу-прототипу [5]. Теоретическая весовая экстинкция для чистой РНК - 20 ОЕ₂₆₀/мг, т.е. при весовой экстинкции 17-18 ОЕ₂₆₀/мг чистой РНК в препарате - 85-90%.

Как видно из чертежа, полученная предлагаемым способом высокополимерная РНК имеет значительно большую молекулярную массу, чем образцы, выделенные из прессованных пекарских дрожжей по способу [6] и способу-прототипу [5]. Таким образом, всыпая сухие пекарские дрожжи без предварительного их замачивания непосредственно в крутой кипяток, мы подавляем высокой температурой активность лизосомальных рибонуклеаз, прежде чем они обводнятся и начнут гидролизовать собственную РНК.

Источники информации

1. Патент РФ № 2103365.

2. Патент РФ № 1708845.

3. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.

4. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - № 3(121). - C.117-121.

5. Авторское свидетельство SU № 936701.

6. Заявка на изобретение № 2008139832/13 (051491).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений, и может быть использовано в медицине. Сухие дрожжи суспендируют в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до рН 7-8, суспензию выдерживают при 99-102°С в течение 40-60 мин, охлажденный до 35-45°С лизат центрифугируют без охлаждения, надосадочную жидкость сливают, затем к слитой жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют без охлаждения, из полученного супернатанта извлекают низкополимерную РНК, а осадок-шрот промывают 2-мя порциями 2-3 М раствора NaCl и 4-мя порциями 92-97%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования. Из полученного шрота высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой и высушивают обычным методом, а этанол регенерируют перегонкой. Из низкополимерной РНК методом гель-фильтрации на Сефарозе-4 В выделяют природные олигорибонуклеотиды. Изобретение позволяет получить высокополимерную РНК со значительно большей молекулярной массой в результате использования сухих пекарских дрожжей без предварительного их замачивания и использования высокой температуры. 4 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей путем суспендирования их в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, центрифугированием охлажденного лизата, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием и промывкой осадка раствором хлористого натрия и этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой, отличающийся тем, что сухие пекарские дрожжи суспендируют в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, суспензию выдерживают при 99-102°С в течение 40-60 мин, центрифугируют охлажденный до 35-45°С лизат в низкоскоростной центрифуге без охлаждения, к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют на низкоскоростной центрифуге без охлаждения, полученный шрот промывают последовательно 2-3 М раствором NaCl и 92-97%-ным этанолом путем его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве литического агента используют пищевой детергент - олеиновую кислоту в концентрации 1-2%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сухие дрожжи без предварительного их замачивания высыпают по порциям непосредственно в крутой кипяток 1-2%-ного раствора олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до рН 7-8.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкоскоростное центрифугирование осуществляют при ускорении 3000 g в течение 10 мин без охлаждения.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что одновременно с высокополимерной РНК получают концентрат кормового белка, низкомолекулярную РНК и природные олигорибонуклеотиды.