ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ Российский патент 2010 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61P35/00 

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к метиловому эфиру 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты формулы (I):

которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием.

Онкологические заболевания являются одной из основных проблем современной медицины, поскольку даже при благоприятном течении заболевания в большинстве случаев не удается достичь полного выздоровления пациента, существенно увеличить продолжительность и улучшить качество его жизни. Предлагаемые на данный момент схемы лечения различного типа злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе в высокодозной агрессивной терапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно-важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи со всем вышесказанным, актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.

Одним из важных направлений медицинской химии, позволяющим получать новые, эффективные противоопухолевые препараты, является использование синтетических трансформаций растительных метаболитов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения и которые являются доступными в настоящее время или станут доступными в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. К данному классу соединений относятся тритерпеновые кислоты, широкий спектр биологической активности которых (противовоспалительная, противовирусная, противоопухолевая, иммуностимулирующая и т.д.) приковывает к ним пристальный интерес исследователей.

Задачей изобретения является создание нового эффективного, низкотоксичного лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием и получаемого из доступного растительного сырья.

Поставленная задача решается новым соединением тритерпеновой природы, а именно метиловым эфиром 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты формулы (1), которое может использоваться в качестве противоопухолевого средства.

Из литературы известно, что некоторые производные тритерпеноидов перспективны как противоопухолевые препараты [Honda T., Janosik T., Honda Y., Han J., Liby K.T., Williams Ch.R., Couch R.D., Anderson A.C., Spom M.B., Gribble G.W. // J. Med. Chem. 2004, 47, 4923-4932]. Так, например, синтетический тритерпеноид CDDO (2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28-овая кислота), полученный из олеаноловой кислоты, проявляет противоопухолевую активность в отношении широкого спектра раковых клеток (IC₅₀ 10^-6-10^-9 M) [Suh N., Wang Y., Honda T., Gribble G.W., Dmitrovsky E., Hickey W.F., Maue R.A., Place A.E., Porter D.M., Spinella M.J., Williams Ch.R., Wu G., Dannenberg A.J., Flanders K.C., Letterio J.J., MangelsdorfD. J., Nathan C.F., Nguyen L., Porter W.W., Ren R.F., Roberts А.В., Roche N.S., Subbaramaiah K., Spom M.В. // Cancer Res. 1999, V.59, P.336-341]. В том числе, CDDO вызывает апоптоз клеток миелоидной лейкемии (IC₅₀ ~10^-6 M) [Konopleva M., Tsao Т., Estrov Z., Lee Ruey-min, Wang Rui-Yu, Jackson C.E., McQueen Т., Monaco G., Munsell M., Belmont J., Kantaqian H., Spom M. В., Andreeff M. // Canser Res. 2004, V.64, P.7927-7935], ингибирует рост клеток эпителиальной карциномы яичников (IC₅₀ 1.1-3.0×10^-6 M) [Melichar В., Konopleva M., Hu Wei, Melicharova K., Andreeff M., Freedman R.S // Gynecologic Oncologe 2004, V.93, P.149-154]. Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и, во многих случаях, относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья.

Одним из таких доступных соединений с ярко выраженными физиологическими свойствами является 18βН-глицирретовая кислота формулы (2) - агликон глицирризиновой кислоты - преобладающего гликозида корня солодки (~90% от общего количества тритерпеновых гликозидов).

С химической точки зрения 18βН-глицирретовая кислота необычна тем, что является единственным природным тритерпеном, содержащим карбонильную группу в 11-м положении [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.Г. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск, Академическое издание «ГЕО», 2007, 312 с.].

Метиловый эфир 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты [метиловый эфир 11-циано-2,4а,6а,6b,9,9,12а-гептаметил-10,13-диоксо-2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,12а,12b,13-гексадекагидропицен-2-оловой кислоты] формулы (1) был получен нами в результате комбинированной модификации колец А и Е 18βН-глицирретовой кислоты формулы (2):

Модификацию проводили согласно схеме 1. В качестве исходного соединения был взят ацетат 18βН-глицирретовой кислоты (3), полученный в результате дегликолизации глицирризиновой кислоты в уксусной кислоте [Толстиков Г.А. Синтетические исследования в области физиологически-активных высших терпеноидов и стероидов. Дис. работа д-ра хим. наук. Уфа. 1969]. Метиловый эфир ацетата 18βН-глицирретовой кислоты (4) получали взаимодействием соединения (3) с диазометаном. Первоначально при взаимодействии соединения (4) с бромом в уксусной кислоте при 80°С и в результате реакции бромирования - дегидробромирования получено соединение (5), содержащее 18,19-двойную связь в кольце Е. Таким образом, был сохранен 11-он-12-еновый фрагмент (уникальный для глицирретовой кислоты), а также удлинена система сопряжения кратных связей.

Следующим этапом являлось получение 2-циано-3-оксо-1-енового фрагмента в кольце А (схема 1). Гидроксильную группу окисляли в кетонную с образованием соединения (7). Производное изоксазола (9) получали формилированием соединения (7) с дальнейшей конденсацией с гидроксиламином. Расщепление изоксазольного кольца метилатом натрия с последующим окислением дихлоро-дицианохиноном (DDQ) приводит к соединению (1).

Элементный состав полученных веществ определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Thermo Electron Corporation.

В работе использовался ацетат метилового эфира глицирретовой кислоты (3) 94%-ной чистоты (ВЭЖХ).

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на спектрометрах АМ-400 (рабочие частоты 400.13 MHz для 1Н и 100.61 MHz для ¹³С) и DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов веществ в CDCl₃. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ_H 7.24 и δ_C 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР ¹Н с привлечением спектров двойного резонанса ¹Н-¹Н, а также анализа спектров ЯМР ¹³С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной ¹³С-¹Н корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, ¹J_C,H 135 Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной ¹³С-¹Н корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия (COLOC, LRJMD, ^2,3J_C,H 10 Гц) с привлечением литературных данных по спектрам для близких по строению фрагментов изучаемых молекул [Wehri F.W., Nishida Т. // Fortschritte Chem. Org. Naturst 1979, 3d, 98-99; Honda Т., Rounds В.V., Bore L., Finlay Н.J., Favaloro F.G., Suh N.. Wang Y., Spom M.В., Gribble G.W. // J. Med. Chem. 2000, 43, 423 3-4246].

Было исследовано влияние заявляемого метилового эфира 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека, клеток нейробластомы человека и опухолевых клеток почки эмбриона человека.

В результате было показано, что заявляемое соединение (1) проявляет высокую противоопухолевую активность по отношению ко всем использованным опухолевым клеточным культурам, включая карциномную линию клеток КВ-8-5, обладающую фенотипом множественной лекарственной устойчивости. При исследовании цитотоксичности соединения (1) по отношению к использованным опухолевым клеткам были получены значения IC₅₀, концентрации соединения, при котором наблюдается гибель 50% клеток. Показано, что значения IC₅₀ для соединения (1) имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне от 50×10^-6 (для линии клеток MCF-7) до 3×10^-6 (для линии клеток КВ-3-1). Полученные данные по противоопухолевой активности соединения (1) позволяют рассматривать его как перспективный лекарственный агент.

Кроме того, при сравнении заявляемого соединения (1) с известным и широко испытываемым противоопухолевым агентом CDDO можно отметить следующее. При практически одинаковой противоопухолевой эффективности заявляемое соединение дешевле агента CDDO, так как 18βН-глицерретовая кислота - исходный продукт при синтезе соединения (1) - является гораздо более доступным и более дешевым соединением по сравнению с олеанолорой кислотой, исходным соединением для синтеза CDDO (стоимость олеаноловой кислоты более чем в 60 раз превышает стоимость 18βН-глицерретовой кислоты).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение ацетата метилового эфира 18βН-глицирретовой кислоты (4)

К смеси ацетата 18рН-глицерретовой кислоты (3) (10 г, 19.0 ммоль) в 200 мл метанола при перемешивании прибавили эфирный раствор диазометана до тех пор, пока раствор не окрасился в бледно-желтый цвет. После полного разложения диазометана (исчезновения характерной окраски) растворитель отогнали на ротационном испарителе и полученный осадок перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ.

(^*Здесь и далее: химические сдвиги (центры мультиплетов) атомов водорода, заключенные в квадратные скобки, получены из двумерных спектров ¹³С - ¹Н корреляции на прямых константах ССВ

^* Химические сдвиги, возможно, следует поменять местами.)

Пример 2. Получение ацетата метилового эфира 18,19-дегидроглицирретовой кислоты (5)

К раствору ацетата метилового эфира глицирретовой кислоты (4) (10.0 г, 19.0 ммоль) в ледяной уксусной кислоты (400 мл) при 80°С в течение 1 часа по каплям прибавляли 5%-ный раствор брома в ледяной уксусной кислоте (70.0 мл, 21,8 ммоль). Реакционную смесь выдерживали 1 час при той же температуре, охладили и вылили в 1.5 л холодной воды. Полученный осадок отфильтровали, промыли водой и сушили на воздухе. Перекристаллизацией из смеси метанол-хлороформ был получено 6.5 г продукта (5) (выход 65.3%). Т.пл. 244-247°С. Найдено, m/z: 524.3490 [М]⁺. C₃₃H₄₈O₅.

Пример 3. Получение метилового эфира 18,19-дегидроглицирретовой кислоты (6)

Раствор ацетата метилового эфира 18,19-дегидроглицерретовой кислоты (5) (6.5 г, 12.4 ммоль) и КОН (45 г, 775.8 ммоль) в метаноле (650 мл) кипятили в течение 1 часа. Реакционную смесь охладили и отогнали большую часть метилового спирта на вакууме, затем добавили этилацетат (100 мл) и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали смесью хлороформ - этилацетат (1:4) (3×750 мл). Объединенный экстракт промывали раствором гидрокарбоната натрия (3х25 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×25 мл). Сушили сульфатом магния. Масса полученного продукта (6) 5.9 г (выход 98.7%). Для получения аналитически чистого образца 100 мг продукта перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Т.пл. 208-210°С.

Пример 4. Получение метилового эфира 3-оксо-18,19-дегидроглицирретовой кислоты (7)

К раствору метилового эфира 18,19-дегидроглицерретовой кислоты (6) (5.8 г, 12.0 ммоль) в ацетоне (400 мл) по каплям прибавляли 6 мл реагента Джонса (бихромат натрия в 33%-ой серной кислоте). Перемешивали 2.5 часа, затем добавили 50 мл этилового спирта и перемешивали еще 30 минут для разложения хромовой кислоты. Реакционную смесь упарили в вакууме до объема ~100-150 мл и вылили в воду (700 мл). Выпавший осадок отфильтровали и высушили на воздухе. Для очистки вещество растворяли в хлороформе и фильтровали через слой окиси алюминия. Масса полученного соединения (7) 5.2 г (выход 90.3%). Для получения аналитически чистого образца 100 мг продукта перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Т. пл.

Пример 5. Получение метилового эфира 2-гидроксиметилен-3-оксо-18,19-дегидроглицерретовой кислоты (8)

К перемешиваемому раствору метилового эфира 3-оксо-18,19-дегидроглицерретовой кислоты (4.2 г, 8.8 ммоль), этилформиата (4 мл, 50.5 ммоль) в бензоле (32 мл) порциями прибавляли метилат натрия (3.0 г, 55.5 ммоль). Перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавили бензол (50 мл) и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали этилацетатом (3×75 мл). Объединенный экстракт промывали раствором гидрокарбоната натрия (3×25 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×25 мл). Сушили сульфатом магния. Масса полученного продукта (8) 4.3 г (выход 96.7%). Для получения аналитически чистого образца 150 мг очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - гексан с градиентом этилацетата 10-15%). Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки.

Пример 6. Получение метилового эфира изоксазоло[4,5-b]-18,19-дегидроглицерретовой кислоты (9)

Смесь метилового эфира 2-гидроксиметилен-3-оксо-18,19-глицерретовой кислоты (4.2 г, 8.3 ммоль), этилового спирта (110 мл) и гидрохлорида гидроксиламина (5,8 г, 83.5 ммоль) в воде (11 мл) кипятили с обратным холодильником 2 часа. Реакционную смесь охладили, спирт удалили на ротационном испарителе, добавили воды, экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенный экстракт промыли раствором гидрокарбоната натрия (3×25 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×25 мл), сушили сульфатом магния. Получили 4.0 г (выход 95.4%) производного изоксазола (9). Для получения аналитически чистого образца 100 мг очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - гексан с градиентом этилацетата 10-20%). Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Найдено, m/z:

Пример 7. Расщепление изоксазольного кольца в соединении (9)

К перемешиваемому раствору соединения (9) (3.9 г, 7.7 ммоль), диэтилового эфира (250 мл) и метанола (120 мл) при охлаждении на ледяной бане порциями прибавляли метилат натрия (15 г). Смесь перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Затем добавили этилацетат и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенный экстракт промыли раствором гидрокарбоната натрия (3×25 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×25 мл), сушили сульфатом магния. Масса реакционной смеси (смесь таутомеров) 3.8 г (выход 97%). Для получения аналитически чистого образца 100 мг очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан с градиентом этилацетата 10-20%). Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Найдено, m/z:

Пример 8. Получение метилового эфира 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1)

Раствор смеси таутомеров (3.7 г, 7.3 ммоль) и 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4-бензохинона (DDQ) (1.91 г, 8.4 ммоль) в бензоле (200 мл) кипятили с обратным холодильником 4 ч. Отфильтровали, фильтрат упарили. Колоночной хроматографией на силикагеле (элюент бензол с градиентом ацетона 0-10%) был получен кристаллический осадок. Перекристаллизацией последнего из смеси метанол-хлороформ был получен целевой продукт (1) массой 3.0 г (выход 84%). Т. пл. 214-217°С. Найдено, m/z 503.3025 [M]⁺. C₃₂H₄₃NO₄. Вычислено М505.3181.

Пример 9. Влияние метилового эфира 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека

Клетки линии КВ-3-1 (эпидермоидная карцинома ротовой полости), КВ-8-5 (линия, производная КВ-3-1, обладающая фенотипом множественной лекарственной устойчивости), HeLa (эпителоидная карцинома шейки матки) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С. Клетки линии КВ-8-5 культивировали в тех же условиях в присутствии 200 нМ винбластина.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением (1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (15000 клеток на лунку для линий КВ-3-1, КВ-8-5 и MCF-7, 7000 клеток на лунку для линии HeLa). Через 24 ч в лунках меняли среду и к клеткам добавляли 0.1 М раствор соединения (1) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 10^-4 до 10^-9 М. Клетки инкубировали в присутствии соединения (1) еще в течение суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в течение 24 ч в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.1). Из данных, приведенных на фиг.1 видно, что обработка клеток различных карциномных линий соединением (1) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединения 10^-6 М. Значения IC₅₀ - концентрация соединения (1), при которой наблюдается гибель 50% клеток - приведены в таблице.

Значения IC₅₀ метилового эфира 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1) для различных карциномных линий клеток человека Линия клеток IC₅₀(1) KB-3-1 3×10^-6 М KB-8-5 5×10^-6 М HeLa 4.8×10^-6 М MCF-7 50×10^-6M

Пример 10. Влияние инкубации с метиловым эфиром 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1) на жизнеспособность клеток нейробластомы человека

Клетки линии SK-N-MC (нейробластома) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 9. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (30000 клеток на лунку). Далее, как в примере 9.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля после их инкубации в присутствии соединения (1) в течение 24 ч. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.2). Из данных, приведенных на фиг.2 видно, что обработка клеток линии SK-N-MC соединением (1) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединения 10^-6 М, что подтверждает высокий противоопухолевый потенциал соединения (1). Значение IC₅₀, полученное для данной клеточной линии, составило 5×10^-6 М.

Пример 11. Влияние инкубации опухолевых клеток почки эмбриона человека с метиловым эфиром 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты (1) на их жизнеспособность

Клетки линии НЕК293 (почка эмбриона человека) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 9. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (20000 клеток на лунку). Далее как в примере 9.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля после их инкубации в присутствии соединения (1) в течение 24 ч. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.3). Из данных, приведенных на фиг.3 видно, что обработка клеток линии НЕК293 соединением (1) вызывает их эффективную гибель при концентрации соединения выше 1×10^-6 М, что свидетельствует о высоком противоопухолевом потенциале соединения (1). Значение IC₅₀, полученное для данной клеточной линии, составило 5×10^-6 М.

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к метиловому эфиру 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой кислоты формулы (I):

которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием. 1 табл., 3 ил.

Метиловый эфир 2-циано-3-оксо-18,19-дегидроглициррет-1-еновой-кислоты формулы (1):

обладающий противоопухолевой активностью.